邹劲 林汤聪 莫湘琼

性激素在肝癌发生中作用的动物实验

邹劲 林汤聪 莫湘琼

目的探讨性激素在大鼠肝癌发生中的作用。方法将大鼠80只随机分成四组:第一组为对照组，饮常水，正常喂食;其余3组饮含二乙基亚硝胺(DENA)水，自由饮用，液体隔日更换，14周后停用DENA，改饮常水，在3组中分别加服用已烯雌酚、甲睾酮和甲孕酮，观察每组肝癌发生情况。结果雌激素组、雄激素组和孕激素组肝癌发生率分别为:30%、85%和55%，3组肝癌发生率具有显著性差异(P＜0.05)。雌激素组第18周仍有大部分为肝硬化。而雄激素组第12周即部分大鼠已经出现肝癌，第16～18周的均已经癌变。孕激素组介于上述两组之间。结论雌激素在大鼠肝癌的发生中具有较强抑制作用，是一个保护因子;孕激素在肝癌的发生中起抑制作用，是一个保护因子;肝癌是一个雄激素依赖性肿瘤，雄激素在肝癌的发生中起促进作用，是一个危险因子。但是三种激素均不是诱发肝癌独立因素或主要因素。

肝癌;雌激素;雄激素;孕激素

原发性肝癌是世界范围内发病率很高的恶性肿瘤之一，全世界每年新增病例超过100万人，尤其以亚太地区居多，是高度恶性、预后差的肿瘤。近年来，随着分子生物学、病毒学及遗传学的进展，普遍认为原发性肝癌的发生是多因素、多途径、多步骤长期作用的结果。临床资料显示:原发性肝癌在男性更为常见，男女发病比例4～7∶1，而且男性肝癌患者的预后较女性差，提示原发性肝癌与性激素之间有着密切关系。本研究主要通过DENA诱发癌过程中添加不同性激素，观察雌激素/性激素和孕激素对诱发肝癌发生的影响。

1 材料与方法

1.1 药物二乙基亚硝胺(DENA)，0.95 g/mL，纯度99.9%，美国Sigma公司产品。给药浓度:第1～2周，1 mL原液+10 L水，第3周开始，2 mL原液+10L水。已烯雌酚1 mg/片(承德九龙药业有限责任公司)，给药剂量:0.1 mg，2次/d。甲睾酮5 mg/片(承德九龙药业有限责任公司)，给药剂量:0.5 mg，2次/d。和甲孕酮2 mg/片(浙江仙居制药厂)，给药剂量:0.25 mg，2次/d。

1.2 诱发大鼠肝癌模型制作用清洁级SD大鼠80只，体重(170±30)g，购自中山大学实验动物中心，均为雌性，所有大鼠分笼饲养，采用标准化光照，自由进食，定期换垫料，适应环境7 d。饲料、垫料等都经过消毒灭菌处理。将大鼠随机分为4组，每组20只，第一组为对照组，饮常水，正常喂食;其余3组饮含药物水，自由饮用，液体隔日更换，14周后停用药物，改饮常水，在3组中分别加服用已烯雌酚、甲睾酮和甲孕酮。

第12、16、18、20和24周处理4只大鼠。打开腹腔，大体观察暴露肝脏，记录肝脏的形态、颜色、质地。取肝脏标本，4%聚甲醛缓冲液固定24 h，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察。

2 结果

2.1 一般情况诱癌4周后，实验组Wistar大鼠进食量下降，并逐步出现毛色枯燥、发黄、无光泽，行动迟缓，体重较对照组增长缓慢，有些大鼠体重明显偏低。自诱癌第8周末，实验组大鼠开始出现死亡，但是3组死亡情况分别为:雌激素组2只(10%)，雄激素组5只(25%)，孕激素组3只(15%)。对照组大鼠均生长良好，未见明显病态表现。3之间死亡率具有显著性差异性(P＞0.05)。

2.2 大鼠肝脏病理学改变10～15周为大鼠的肝硬化期，大体标本:肉眼可见肝表面及切面可见1～2 mm左右的白色颗粒状结节，镜下为肝硬化结节。第17～20周为大鼠的癌变期，大体标本的肝表面及肝切面可见3～25 mm的结节，镜下呈癌组织改变。各组结果详见表1。

3 讨论

DEN为国际肿瘤研究中心机构(International agency for research on cancer，IARC)确定的致癌物质，对肿瘤的发生具有启动和促进的双重作用。本研究结果证实应用DEN诱发大鼠肝癌模型可靠性。但是由于DENA的毒性作用，使部分大鼠肝细胞死于肺部感染或肝癌组织破裂出血。DENA诱癌过程中形态与病理变化特征，可以分为4个阶段［1］。第一阶段为肝硬变前期，为诱癌第1～8周;第二阶段为肝硬变期，为诱癌第8～14周;第三阶段为早期癌变期，为诱癌第14～18周;第四阶段为演进期，为诱癌的第18～20周。

关于性激素在肝癌发生中作用目前尚无定论。周载平等［2］认为肝癌癌变特定阶段雄激素受体表达活跃，AR水平呈现自癌瘤到癌周组织的区域性递减变化，提示其可能有介导雄激素的促肝细胞异常增殖作用。动物试验及临床研究证明，雄性激素能诱导肝癌，肝硬化和肝癌患者中存在雄性激素异常。雄激素和AR参与肝癌细胞表达的调控［3］。对患上慢性肝炎、但还未发展成为癌症的1岁老鼠进行阉割，将会起到保护作用。给老鼠注入一种强力男性激素，来观察其是否会促进肿瘤发展。结果，这两种方法都没有奏效，这也证明了男性性激素，如睾丸激素，并不会直接促进成鼠患上肝癌。这项研究是首次在基因组范围研究性别对非生殖器官癌的影响，这项研究的结果刊登在2007年12月15日的《癌症研究》杂志上。

也有文献认为肝癌的发生、发展及生物学特性可能与肝癌组织中ER、ERβ的阳性表达降低、变异或缺失有关，男性肝癌组织中的ER较易发生变异或缺失，ERa基因多态性与原发性肝癌有关，P等位基因可能是其保护因素，X等位基因可能是其危险因素，ERδ5作为显性阴性突变体，在肝癌细胞中直接抑制ERα的转录活性［4-6］。Nagasue［7］分别对25例肝癌伴肝硬化、肝硬化患者血浆E1、E2、E3、T水平检测，未发现组间明显差异，但E/T的比值却存在明显差异，说明E与T比例失衡与HCC发生有一定关。肝癌癌变过程中，雌激素受体发生缺失，肝癌受体正常功能的丧失可能与肝癌的发生发展相关［8］。Henryk［9］报道雌激素加致癌物NUM(N2〛nitrosomorpholine)，对于卵巢切除后的雌性小鼠，引起肝结节增生占23/31，发展成肝细胞性肝癌(HCC)占9/31，仅用NUM引起肝结节增生与HCC各占11/31，3/31;仅用雌激素则不会引起肝细胞增生，更不会引导起HCC，提示雌孕激素在HCC复制中仅起一定的促进作用。肝癌患者给予雌激素治疗并不能取得良好的效果［10］。

本研究显示:雌激素组、雄激素组和孕激素组肝癌发生率分别为:30%、85%和55%，3组肝癌发生率具有显著性差异(P＜0.05)。雌激素组第18周仍有大部分为肝硬化。而雄激素组第12周即可见部分大鼠已经出现肝癌，第16～18周的均已经癌变。孕激素组介于上述两组之间。提示雌激素在大鼠肝癌诱发过程中具有抑制作用，而雄激素则有促进作用。

作者认为:①雌激素在肝癌的发生中具有较强抑制作用，是一个保护因子。②孕激素在肝癌的发生中起抑制作用，是一个保护因子。③肝癌是一个雄激素依赖性肝癌，雄激素在肝癌的发生中起促进作用，是一个危险因子。但是三种激素均不是诱发肝癌独立因素或主要因素。

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［10］Michael Karin.Gender Disparity in Liver Cancer Due to Sex Differences in MyD88-Dependent IL-6 Production Science 6 July 2007:317(5834):121-124．

Animal experiments of the role of sex hormones in the liver cancer

ZOU Jin-lin，TANG Cong，MO Xiang-qiong.The Fifth Affiliated Hospital of Zhongshan University，Zhuhai 519000，China

ObjectiveTo study effect of sex hormones in the development of rat hepatocellular carcinoma Methods80 rats were randomly divided into four groups:the first group was the control group，drank mineral water，ate normal feeding，the other 3 groups drank water containing DENA，liquid after was replaced，after 14 weeks DENA was stopped and drank mineral water，in the 3 group were added with diethylstilbestrol，testosterone and armor progesterone respectively，the hepatocellular carcinoma incidence in each group was observed. ResultsEstrogen，androgen and progesterone group the incidence of liver cancer are:30%，85%and55%respectively，three groups of liver cancer incidence rate had significant difference(P＜0.05).Most of estrogen group still were cirrhosis of the liver in the eighteenth week.However，part rats had appeared liver cancer in the 12thweeks，16 to 18 weeks were cancerous in androgen group.Progesterone group was between the two groups. ConclusionEstrogen in rat liver tumors have stronger inhibition is a protective factor;Progesterone in liver tumors inhibition plays，is a protective factor，Liver cancer is a androgen dependence tumor，androgen in liver tumors contribute in，is a risk factors.But the three types of hormones are not induce lier cancer independent factors or main factors．

Liver cancer;Estrogen;Androgen;Progesterone

519000珠海，中山大学附属第五医院

表1

组别例数肝硬化率(%)肝癌率(%)死亡率(%)＜0.05＜0.05＜0.05 20000雌激素组20553010雄激素组20908525孕激素组20805515 P值对照组