邱绪建，耿 伟，刘光明，陈胜军，林 洪

(1.集美大学生物工程学院，福建厦门 361021;

2.陕西省咸阳市质量技术监督局食品安全风险监测中心，陕西咸阳 712000;

3.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，广东广州 510300;

4.中国海洋大学水产品安全实验室，山东青岛 266003)

代谢组学方法在食品安全中的应用研究进展

邱绪建1，耿 伟2，刘光明1，陈胜军3，林 洪4，*

(1.集美大学生物工程学院，福建厦门 361021;

2.陕西省咸阳市质量技术监督局食品安全风险监测中心，陕西咸阳 712000;

3.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，广东广州 510300;

4.中国海洋大学水产品安全实验室，山东青岛 266003)

代谢组学方法作为一个新兴的重要研究工具，在药物研发、疾病诊断、植物生理、食品营养学及环境科学等很多领域中得以广泛应用。本文主要介绍代谢组学的研究方法在食品安全分析应用中的最新进展，以推动我国在快速检测检验方面的技术进步和突破，从而达到保障食品安全的目的。

代谢组学，快速检测方法，食品安全

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，为当前研究的热点之一。代谢组学的目标是全面研究生物体系代谢产生的小分子代谢物(分子量通常＜1500u)，然后通过这些代谢组分的指纹分析得到有用的信息［1］。代谢组学对人类疾病、新药研发、食品营养学、植物生理及环境科学等研究都有重要的推动作用，并日益成为非常重要的研究工具［2－6］。近年来，气质联用色谱(GC－MS)，液质联用色谱(LC－MS)及高通量高分辨率核磁共振谱(NMR)等技术手段被广泛应用。此外，用于化合物分析的色谱图处理软件和数据库也不断更新完备，这使得小分子化学物质的分离鉴别相对快速简易，代谢组学研究因而得以迅速发展完善［7－10］。代谢组学研究可分为非靶向代谢组学和靶向代谢组学。非靶向代谢组学(又称发现代谢组学)以发现尽可能多的代谢产物，从而获取代谢产物的产生模式或者指纹分析为主要的研究方向。非靶向代谢组学通常寻找有统计学意义的代谢物，并与所研究的生物状态或过程进行关联，揭示其内在的变化规律。靶向代谢组学分析是以预先确定的一组化合物为分析目标，需要准确的定性和定量分析［11］。靶向代谢组学通常验证事先提出的假设，针对特定的一组代谢物，研究其变化特点。靶向分析一般需要对分析样品进行选择性的提取和较高程度的纯化，以尽可能去除与测定目标无关的干扰物质。我国近年来食品安全事件屡屡发生。根据卫生部报道，2010年全国因微生物污染造成的食物中毒有81起，4585人中毒，16人死亡。微生物性食物中毒事件的报告起数和中毒人数最多，分别占总数的36.82%和62.10%［12］。因此，为适应公共卫生事件应急处理快速反应的需要，研发食源性致病菌的快速检测方法，对于加强对食源性致病菌的监测和控制具有重要意义。代谢组学方法作为一个新兴的重要研究工具在食源性致病菌检测中的应用潜力不容忽视。

此外，不法分子对食品故意掺假也造成了严重的食品安全问题，给人民群众的健康和生命安全带来威胁。传统的感官评价和常规质量指标检测往往难于区分掺假食品。代谢组学的方法着重于食品所有成分组成的整体定性定量分析，因而能对掺假的食品加以科学的区分鉴别。代谢组学方法在分析评价转基因食品中也能发挥重要作用。转基因食品的化学成分组成及含量和传统食品之间的差异借助于代谢组学这个研究工具可以得到快速简便的识别。这对于转基因食品的安全评价和转基因食品的监管都有重要意义。本文就代谢组学的研究方法及其在食品安全检测分析中的应用研究做一综述。

1 代谢组学的研究方法

代谢组学研究的一般流程包括实验设计、样品收集及处理、分离检测、数据处理及分析、生物标志分子的发现和确认及生物学意义解释等，其中检测和数据处理较为重要，是代谢组学不可或缺的重要步骤［6］。

1.1 样品收集及处理

样品收集及处理要根据研究目的进行设计。固体样品如土豆可在液氮条件下粉碎或者用冻干的方法。通常冻干处理可以使代谢产物浓缩富集，而且能避免不同批次的样品之间水分含量的差异给分析结果带来的影响［13］。对于非靶向代谢组学的研究，因为要分析的化学物质并不预知，这就需要对于几种溶剂和提取方法进行比较，以尽可能得到全面的分析结果。不同生物样品特点各异，具体提取方法需要通过实验确定最优方案［14］。靶向代谢组学因为已知需要提取物的化学特性，可以有针对性的选择溶剂和提取方法。如Cavaliere［15］等用甲醇/水/甲酸70∶30∶1对葡萄果实当中多酚化合物进行提取。提取物在分析前有时需要衍生化，衍生化通常是进行气相色谱(GC)分析前为使检测物易于挥发而做的化学处理。

1.2 分离检测

分离检测是代谢组学的一个关键步骤。现有的分离检测技术平台有高压液相色谱(HPLC)、超高压液相色谱(UPLC)、气相色谱(GC)、毛细管电泳(CE)等分离方法以及紫外(UV)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)和近红外光谱(NIR)等检测方法［4］。液质联用(LC－MS)及气质联用(GC－MS)分析较为常见。另外，直接进样质谱法(Direct infusion MS)技术不需要分离步骤，可直接进样分析较快取得结果，但其离子化易受基质影响［16］。对于各种分离检测技术在代谢组学方法中应用存在的优缺点，很多综述作了较为深入详细的介绍［4，17－19］。随着高通量及高灵敏度分离检测技术的不断进步，代谢组学无疑将会得到进一步发展。

1.3 数据处理及分析

代谢组学的数据处理及分析主要包括化学物定性定量和统计学分析。分离的化学物质通过色谱数据库检索并和标准品的保留时间进行对比来定性鉴别。代谢组学数据分析以多维数据分析(Multivariate Data Analysis，MVDA)为主。常见的有主成分分析法(Principal Component Analysis，PCA)，主成分分析法可以用来归类区分不同处理样品之间的不同。其他方法还有神经网络分析方法(Neural Network，NN)，簇类分析(Hierarchical Cluster Analysis，HCA)等。代谢组学的数据处理也包括统计预测模型的建立。这其中偏最小二乘法(Partial Least Square，PLS)最为常用［6］，其他还有偏最小二乘法显著性分析(PLSDiscriminant Analysis，PLSDA)，软独立建模分类法SIMCA(Soft Independent Modeling of Class Analogy，SIMCA)等［20－21］。统计方法的选择是根据研究需要而定，代谢组学的大量数据结果需要利用统计学软件来分析，其中包括MATLAB、SAS、SPSS、SIMCA等。Hiller等［22］设计了一个 MetaboliteDetector的免费软件，专门用来处理气质色谱数据分析。

1.4 生物标志分子的确认及其生物学意义解释

代谢组学的研究极有可能发现生物标志分子。生物标志分子的发现和确认，可以提供非常有价值的信息，对于解释生物代谢的变化规律和相关机制具有重要意义。如生物标志分子的检测可以用于疾病的早期诊断、微生物的检测、药物毒理的评价等［23］。

2 在食源性致病菌快速检测中的应用

食源性致病菌在生长过程中能合成并释放出有机小分子物质。通过检测分析这些小分子物质，可以有助于推断是否有致病菌的存在。由于很多微生物的许多挥发性代谢产物有较高的相似性，仅凭一两种代谢组份往往很难区分不同种类的微生物。代谢组学的研究可以对不同微生物生长过程中所有这些挥发性代谢产物的产生模式进行统计学上的多维数据分析，得出准确可靠的判断。而在分析这些代谢产物的过程中，也很有可能发现某个或某些特异性的生物标志分子，从而更加有利于目标致病菌的检测。如Tian等［24］研究发现通过气质联用色谱，转基因的大肠杆菌和普通大肠杆菌可以区分开来。这其中琥珀酸、脯氨酸和天门冬氨酸是用来区分的主要的标志性代谢物。

2.1 食源性致病菌快速检测的方法

食源性致病菌的检测方法很多。传统检测方法时间长，需要进行很多项生化实验分析才能得到确认结果，过程繁琐而且耗时耗力。因此，研究快速简便的检测食源性致病菌的方法是目前食品微生物安全领域研究的热点之一。分子生物学的聚合酶链式反应(PCR)和酶联免疫(ELISA)的方法是目前主要的快速检测技术。这些方法要对样品进行富集培养增菌，还包括DNA提取和扩增、荧光探针杂交、各种酶、试剂和PCR仪器等，增加了检测的复杂程度，往往需要24～48h才能得到结果。而且这些技术如操作不当，还易造成假阳性或假阴性结果的出现［25－26］。表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)检测速度很快，大约1h，但是检测限非常高［27］。代谢组学方法的研究目标是致病菌的代谢小分子的产生规律，与分子生物学PCR检测方法思路有明显区别，下面对其在食源性致病菌检测的研究现状做一简要概述。

表1 代谢组学法在食源性致病菌检测中的应用研究Table 1 Application study on rapid detection of foodborne pathogens by metabolomics

2.2 代谢组学方法在食源性致病菌检测中的应用

国内外关于代谢组学在食源性致病菌的快速检测上的应用研究尚不多见。表1总结了最近的有关这方面的一些研究概况。

Nakai等［28］利用气相色谱研究了牛肉和三文鱼样品中沙门氏菌的检测方法，没有利用富集培养液，直接对牛肉保温增菌，然后分析了病菌污染样品的挥发性代谢产物的产生模式，结果发现能够区分污染样品和对照品，但何种病菌仍需进一步确证。Ogihara等［29］在后续研究中，调查了沙门氏菌和其他5种病菌在胰蛋白胨大豆肉汤培养液(Tryptic Soy Broth，TSB)的生长代谢模式并成功进行了检测，而且提出了先把牛肉样品保温培养，然后再到培养液中增菌，提取挥发性代谢物以鉴别细菌的方法。

Siripatrawan和 Harte［30］利用固相微萃取和气质联用色谱分析的方法，检测污染沙门氏菌的苜蓿芽包装产品。该方法对样品挥发性小分子直接顶空取样，提取制备相对简单。检测的沙门氏菌起点在10000CFU/g，检测限过高，但建立的统计模型能较好的利用挥发性代谢产物分析结果来预测沙门氏菌总数。

Xu等［31］发现猪肉中的腐败菌和沙门氏菌在常温保存下所产生的代谢物不同，因而能加以区分猪肉是否污染沙门氏菌。该研究发现缬氨酸、肌酐、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸等代谢产物能起重要的区分作用，能否作为沙门氏菌在猪肉中检测的生物标志分子，有待于进一步研究确认。研究结果显示了代谢组学指纹分析方法是一个很有应用价值的研究工具。

Bhattacharjee等［32］研究比较了鲜牛肉和熟成牛肉污染沙门氏菌和对照样品中挥发性有机分子的组成的不同。顶空固相微萃取结合气质色谱分析结果发现某些挥发性分子如3－羟基－2－丁酮是随着沙门氏菌的生长繁殖而增加的(p＜0.05)。该研究仅定性比较检测了少数几种代谢物的产生规律，尚不能应用到具体检测中。

Cevallos－Cevallos等［33］对鸡肉和绞牛肉中大肠杆菌O157∶H7及沙门氏菌进行了检测。他们分别用毛细管电泳二极管阵列检测方法、液质色谱和气质色谱对代谢产物进行分离鉴别。气质色谱分析得到的图谱信息更丰富而且更易区分对照样品和病菌污染样品，因而气质分析被采用。在细菌培养液生长代谢的气质色谱分析结果的基础上，研究者设立统计模型并正确检测了含有大肠杆菌O157∶H7或沙门氏菌的培养液样品，但是尚不能完美的预测食品样品中是否污染大肠杆菌O157∶H7或沙门氏菌。研究者因此将污染病菌后的绞牛肉和鸡肉样品的数据加入模型后得到新的统计模型，从而完全正确的预测了食品样品中的病菌，没有假阳性或假阴性结果出现。

3 在检测食品掺假中的应用

受利益驱动，食品掺假现象层出不穷。如在牛奶中添加三聚氰胺、食用油中添加地沟油、纯果汁中添加糖和柠檬酸、初榨橄榄油混掺其他低廉食用油等。常规食品分析检测目标单一，往往不能检出这些掺假食品。代谢组学基于全面分析食品成分组成的整体分析方法，因此在检测非特定目标物方面有其他检验方法所没有的优势。研究表明，很多掺假食品可以通过代谢组学的技术手段来鉴别。Hajimahmoodi等［34］利用气相色谱和偏最小二乘法统计模型来检测棉籽油、橄榄油、豆油及葵花籽油的混合物。所建立的统计模型能较好的对这四种油组成分别定量，从而可以对每种食用油是否添加其他种类的油做出快速判断。Surowiec等［35］利用代谢组学的研究方法对机械回收肉(Mechanically recovered meat)和手工剔骨肉等进行了区分。机械回收肉是用高压处理胴体碎块，除去不可食用的组织后剩下的肉糊，价格低廉，消费者不认可。欧盟规定此类产品不属于肉的范畴。研究结果表明，气质联用色谱分析结合统计模型预测的方法能就机械回收肉和其他不同来源的肉样品及香肠制品进行判断区分，具有实际应用价值。Ogrinc［36］利用同位素比质谱法(Isotope Ratio Mass Spectrometry，IRMS)对果汁掺假、葡萄酒掺假和橄榄油掺假进行了分析研究。分析检测结果可以通过主成分分析法(Principle Component Analysis，PCA)或人工神经网络(Artificial Neural Networks，ANN)处理来区分掺假产品和正常产品。可以预见，代谢组学方法在食品掺假检测的应用将会越来越广泛而极有可能成为检测掺假食品的主要技术手段。

4 在检测转基因食品安全分析中的应用

转基因食品的安全评价中有一个实质等同性的原则［37］。这需要对转基因食品成分和传统对照的非转基因食品进行分析比较差异。代谢组学的分析检测技术手段如气质联用色谱、液质联用色谱、毛细管电泳质谱和核磁共振等都可以检测分析转基因食品的成分组成。Chang等［38］对转基因大米和非转基因大米用非靶向代谢组学方法进行分析，发现转基因大米和非转基因大米成分差异不大，而环境因素引起的成分差异较为显著。Kim等［39］用傅立叶红外光谱和核磁共振仪器对转基因土豆和非转基因土豆做了比较分析。多维数据分析结果表明，转基因土豆和非转基因土豆实验样品并无显著区别，反而新鲜土豆和贮藏一周后的土豆差异明显。该研究显示了代谢组学能有效评估转基因产品成分组成差异，是一个快速而简便的方法。

5 结论

总之，代谢组学是一种新兴的重要的技术手段，在食品安全分析检测中已经充分显现出了其潜力和优势。近年来，人民群众对于食品安全和营养健康日益关注，充分利用代谢组学这个研究工具，建立灵敏可靠特异的快速检测方法，对于预防和减少食源性疾病的发生、监控检测食品掺假、加强转基因食品安全、保障人民群众健康等都具有重要的现实意义。

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A review on the application of metabolomics method in food safety

QIU Xu－jian1，GENG Wei2，LIU Guang－ming1，CHEN Sheng－jun3，LIN hong4，*
(1.College of Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China;2.Quality and
Technical Supervision Bureau，Food Safety Risk Monitoring Center of Xianyang，Xianyang 712000，China;
3.Chinese Academy of Fishery Sciences，The South China Sea Fisheries Research Institute，Ministry of Agriculture Key Laboratory of Aquatic Products Processing，Guangzhou 510300，China;
4.Ocean University of China Aquatic Product Safety Laboratory，Qingdao 266003，China)

Metabolomics is an emerged important research tool after genomics and proteomics.Recently，metabolomics had been widely used in many disciplines including drug discovery，disease diagnosis，plant physiology，food science and environmental science.This review introduced the basic research process of metabolomics and its application in food safety.The advances in this research field could help to improve the rapid detection technology in China and ensure food safety.

metabolomics;rapid detection method;food safety

TS201.6

A

1002－0306(2012)21－0369－05

2012－04－23 *通讯联系人

邱绪建(1974－)，男，博士，研究方向:食品质量与安全。

“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD28B05);集美大学科研基金资助。