雷用东，陈姗姗，赵晓燕，张 莉，马 越，童军茂，*

(1.石河子大学食品学院，新疆石河子 832003;

2.北京市农林科学院，北京 100097)

紫甘薯花色苷制备及其抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)活性的研究

雷用东1，陈姗姗2，赵晓燕2，张 莉2，马 越2，童军茂1，*

(1.石河子大学食品学院，新疆石河子 832003;

2.北京市农林科学院，北京 100097)

为研究紫甘薯花色苷对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的抑制作用，实验纯化了紫甘薯花色苷提取物，并采用液质联机的方法鉴定其结构组成;将制备的花色苷提取物作用于侵染TGEV的猪睾丸(ST)细胞，研究对TGEV诱导ST细胞的形态学变化和凋亡情况的影响，揭示花色苷对TGEV的预防和治疗效果。结果表明:紫甘薯花色苷提取物中主要含8种花色苷。花色苷质量浓度低于60μg/mL时，ST细胞生长良好且无细胞毒性;接种TGEV后，20μg/mL的花色苷就能抑制TGEV的增殖，且在安全浓度范围内抑制程度成剂量关系。在此体外实验中，花色苷对TGEV的预防效果比治疗效果更明显。结论:紫甘薯花色苷在20～60μg/mL质量浓度范围内对TGEV有很好的抗病毒功效。

紫甘薯，花色苷，猪睾丸细胞，猪传染性胃肠炎病毒，MTT法

花色苷属于生物类黄酮，是一种多酚类化合物［1］，具有多重生物活性功能，如清除体内自由基;降低氧化酶活性;抗氧化、抗突变、抗肿瘤和抗过敏;抑制金黄色葡萄球菌生长的作用;减轻肝功能障碍和预防心血管疾病等功效［2－8］，广泛应用于饮料、果汁、糖果、果酱、保健品饮料等食品工业及医药和化妆品领域，然而关于对病毒作用的研究未有报道。紫甘薯花色苷是从紫甘薯的块根中浸提出的一类天然的花色苷色素(Anthocynins from Purple Sweet Potato，APSP)，色泽鲜亮、安全、无毒、无异味。猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)能够导致猪传染性胃肠炎，使出生仔猪大批死亡，带来巨大的经济损失［9－10］，本研究以紫甘薯花色苷为研究对象，以ST细胞为宿主细胞，研究花色苷对TGEV诱导的细胞形态学变化及凋亡率的影响，揭示其抗TGEV功能，开辟了花色苷抗病毒研究的新领域，为猪传染性胃肠炎预防与治疗提供新思路，具有重要的理论及实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

紫甘薯 购自北京市农林科学院彰化农贸市场;猪睾丸(ST)细胞系 由北京市农林科学院畜牧所高室提供;MEM培养基、胎牛血清(FBS) Thermo公司;胰蛋白酶 美国BD公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 北京冬歌生物科技有限公司，分析纯;二甲基亚砜(DMSO)、3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴盐(MTT) Sigma公司;其余试剂 为国产分析纯。

紫外可见分光光度计UV－3802型 上海尤尼柯公司;液质联用仪(HPLC 1200 series，MS IonTrap 6310) 安捷伦公司;超净工作台SW－CJ－2FD 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;CO2水套式培养箱4520型 美国NAPC0公司;倒置显微镜TE300日本Nikon公司;酶标仪550 美国Bio－Rad公司;细胞自动计数分析仪CYT－100 日本CYTORECON公司。

1.2 实验方法

1.2.1 紫甘薯花色苷样品的制备 提取溶剂为60% (V/V)的乙醇水溶液，并用1mol/L的盐酸将提取溶剂的pH调为3.0;料液比为1∶8;提取温度50℃;提取时间2h;提取次数1次。

将粗提液过AB－8大孔树脂纯化。上样后，采用3倍柱体积的蒸馏水除去蛋白、多糖等杂质，用60%的乙醇溶液洗脱，得到纯化后的花色苷提取液，旋蒸浓缩后得到纯化的紫甘薯花色苷浓缩液，真空干燥得到紫色粉末。采用0.01mol/L PBS将紫甘薯花色苷配制成1mg/mL的质量浓度，0.22μm滤膜过滤备用。

1.2.2 紫甘薯花色苷的主要成分分析 液质联机的条件如下，HPLC设定的参数:柱温:25℃;流速: 0.3mL/min;进样量:3μL;流动相A:0.5%甲酸水溶液;流动相B:0.5%甲酸乙腈;洗脱梯度:0min 10% B;30min 60%B;32min 10%B;DAD检测器:花色苷的定量计算使用检测波长520nm。

MS设定的参数:干燥气温度为350℃;N2流速为11L/min;电压3500V;喷雾器压力为30psig;离子扫描范围为100～2200(m/z)。整个过程均采用正离子模式，数据使用 Agilent Chemstation Rev.A.09.01 software(Agilent，Palo Alto，CA)统计分析。

1.2.3 ST细胞的复苏和传代培养 从－196℃液氮中取出细胞冻存管，迅速投入37℃的水浴中适当摇晃，使冰冻的细胞迅速融解(40～60s内)，用毛细吸管吸出细胞悬液，置入预先按每毫升细胞悬液内加入5倍量预热至37℃的含20%FBS的MEM营养液的25cm2培养瓶中，置于37℃的5%CO2温箱内培养4～12h。在细胞贴壁后，即可换入新含10%FBS的MEM营养液，继续培养至长成单层后换液或传代。按1∶2传代，0.25%胰蛋白酶消化后，加入10%FBS的MEM营养液，于37℃、5%CO2培养箱进行培养。

1.2.4 紫甘薯花色苷对ST细胞生长的影响 用生长液调节ST细胞浓度为1～5×105cells/mL，每个孔200μL将ST细胞液滴于96孔细胞培养板中，待细胞铺满成单层80%左右，弃培养液。随后用无血清培养液洗一次，再用含2%FBS的MEM维持液调节紫甘薯花色苷质量浓度为 20、30、40、50、60、70、80μg/mL，总体积为200μL/well，于37℃继续培养，分别在培养24h和72h采用MTT法测定，弃液，每孔加入15μL MTT溶液(MTT质量浓度为5g/L)，37℃孵育4h后小心弃液，每孔加170μL DMSO，振荡摇匀10min。最后在490nm单波长下测定各孔吸光值，通过OD值的大小间接反映细胞存活情况［11］。设细胞对照组，每个质量浓度分别做6个平行孔，以减少误差。同时，用显微镜观察细胞形态变化。

1.2.5 紫甘薯花色苷体外抗TGEV活性的研究 预防效果实验:按照上述APSP对ST生长实验方法铺96孔板，待细胞铺满80%，接入不同质量浓度紫甘薯花色苷，37℃孵育1～2h，随后按体积的10%再接入稀释后的TGEV，孵育1～2h后，加入维持液继续培养，分别在48h和72h时，测定OD490。治疗效果实验:待细胞铺满80%左右时，先接入病毒孵育1～2h，再接入不同质量浓度紫甘薯花色苷和维持液，最后测定其OD490。

1.2.6 数据分析 本实验结果数据采用Origin8软件作图和DPS统计软件分析，实验数据均以¯X±S表示，多组间采用单因素ANOVA分析，多重比较采用q检验，p＜0.05有统计学意义即有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 紫甘薯花色苷提取物的HPLC-MS成分分析

紫甘薯花色苷的HPLC见图1。多峰状态显示紫甘署含多种组份，八个主峰为其主要的成分组成。结合质谱信息，根据其保留时间、UV图谱、母离子及子离子碎片信息，并参考其它文献［12－15］，鉴定了八种主要成分的结构。

图1 紫甘薯主要花色苷的HPLC－MS色谱图(520nm)Fig.1 HPLC－MS profiles(520nm) of the major anthocyanins from purple sweet potato

紫甘薯块根中的花色苷主要成分见表1，与前人研究结果相同，主要是不同酰基化结合的芍药糖苷及矢车菊糖苷［15－18］。

2.2 紫甘薯花色苷对ST单层细胞生长的安全浓度研究

安全浓度是指对单层细胞无影响的最小药物稀释度，本文通过不同质量浓度的紫甘薯花色苷作用于ST单层细胞，检测其生长情况，明确花色苷的安全浓度，结果见表2。

从表2可知，紫甘薯花色苷与ST细胞作用48h和72h后，质量浓度在20～40μg/mL时，均显著地促进了ST细胞的生长，培养72h较48h的促进效果更强，尤其浓度在20μg/mL时，较对照组(OD值=0.558)提高了21%。但是，当质量浓度高于70μg/mL时，OD值逐渐降低，对细胞生长有影响，由此明确花色苷对ST细胞的最大安全浓度为60μg/mL。

延长培养时间，第5d时对照细胞开始慢慢脱落单层而死亡，低浓度的花色苷处理组仍能保持单层细胞，可见紫甘薯花色苷直接影响了ST细胞生长和存活时间。紫甘薯花色苷是优良的天然抗氧化剂，史海英等［19］研究发现花色苷对细胞有抗辐射损伤作用，同时资名扬等［20］研究证实:紫甘薯花色苷有抗氧化性，并对细胞免疫系统具有调节作用，因此一定浓度范围内可能提高了ST细胞机能，从而促进其生长。

表1 紫甘薯中主要的花色苷组分Table 1 The major anthocyanin components of purple sweet potatoes

表2 紫甘薯花色苷对ST细胞生长的影响(±S，n=6)Table 2 Effect of APSP on the influence of ST cell growth(±S，n=6)

表2 紫甘薯花色苷对ST细胞生长的影响(±S，n=6)Table 2 Effect of APSP on the influence of ST cell growth(±S，n=6)

注:ST对照为未处理组;每一列(或每一行)中数据上标字母完全不同表示数据间存在显著性差异(p＜0.05)。

项目 ST对照 紫甘薯花色苷浓度(μg/mL) 20 30 40 50 60 70 80 48h 0.536±0.020b0.633±0.032a0.65±0.020a0.697±0.014a0.585±0.036b0.547±0.045b0.408±0.094c0.377±0.032c 72h 0.558±0.030c0.676±0.038a0.623±0.040b0.607±0.012b0.568±0.034c0.512±0.029d0.392±0.029e0.244±0.028f

2.3 紫甘薯花色苷体外抑制TGEV活性的研究

紫甘薯花色苷对ST细胞单层生长的最大安全浓度为60μg/mL，因此实验在安全浓度范围内研究其抗TGEV的活性。

从图2可知，ST细胞接入TGEV培养48h后，ST细胞存活率仅为18.91%，当加入20μg/mL的紫甘薯花色苷进行预防实验处理时，ST存活率为39.84%，随着浓度增加抑制效果增强，尤其在60μg/mL时，细胞的存活率比未加花色苷的 TGEV对照提高了60.61%。结果显示对TGEV具有明显的预防作用。

图2 不同浓度紫甘薯花色苷体外抑制TGEV的作用(48h)Fig.2 Influence of prevention and treatmenton TGEV under different concentration of APSP

治疗方面，与预防趋势大体一致。其中，20μg/mL浓度下ST细胞的存活率为20.29%，随着浓度增加抑制效果增强，在质量浓度50μg/mL时的存活率比未加花色苷的TGEV对照组高出41.82%。结果显示紫甘薯花色苷对TGEV具有治疗作用，治疗效果与浓度成剂量关系。然而与预防作用比较，治疗效果明显偏低。

从图3可知，以ST细胞为参照，培养72h，病毒对照组的ST细胞存活率趋近于零，此时ST细胞全部发生病变、脱落死亡。加入20μg/mL花色苷的预防实验处理组的ST存活率为3.44%，增加到60μg/mL时，存活率为13.94%，与48h比较，ST细胞的存活率较低，大部分细胞脱落死亡。治疗方面，抗病毒趋势与预防作用一致，然而治疗效果明显低于预防处理。此外，无论是治疗还是预防实验，抑制病毒诱导的细胞凋亡的能力均明显低于48h的效果，可见，此体外实验中，花色苷抑制TGEV活性时需及早处理，并且预防效果更好。

图3 不同浓度紫甘薯花色苷体外抑制TGEV的作用(72h)Fig.3 Influence of prevention and treatment on TGEV under different concentration of APSP

2.4 紫甘薯花色苷与TGEV对ST细胞形态学的影响

倒置显微镜图显示:正常的ST细胞贴壁后(图4A)，在显微镜下多为多角形或短梭形，当铺满瓶底时，呈铺路石状，大小均匀。60μg/mL紫甘薯花色苷处理72h后(图4B)，ST单层表面完整，细胞大小均一，细胞饱满，形成完整单层，无空隙，细胞折光性良好，无破碎死亡，不影响细胞的生长。细胞进行病毒侵染48h(图4C)，发生严重的病变，无正常细胞形态，极少贴壁，细胞全部脱离单层。质量浓度60μg/mL紫甘薯花色苷作用于接入TGEV的ST细胞培养48h(图4D)，结果显示部分细胞脱离单层，细胞数也明显较稀疏，细胞收缩或者膨胀、变圆，细胞间隙增加，与未加花色苷的病毒对照组比较，能保护ST的细胞结构，抑制TGEV增殖和延长ST细胞的寿命。

图4 紫甘薯花色苷对ST细胞形态的影响(×200)Fig.4 Effect of APSP on ST morphology under microscope(×200)

3 结论

本文分离鉴定了紫甘薯花色苷主要为含有八种不同酰基化结合的芍药糖苷和矢车菊糖苷。制备的紫甘薯花色苷质量浓度低于60μg/mL时，对ST细胞生长无毒性。质量浓度20～60μg/mL能够显著抑制TGEV诱导的ST细胞结构变化，降低凋亡率，抑制程度成剂量关系。在此体外实验中，花色苷对TGEV的预防效果比治疗效果明显。本文初步研究表明紫甘薯花色苷对猪胃肠炎病毒具有抑制作用，但其抑制机制有待进一步的研究。

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Preparation and anti－TGEV activity of anthocyanin from purple sweet potato

LEI Yong－dong1，CHEN Shan－shan2，ZHAO Xiao－yan2，ZHANG Li2，MA Yue2，TONG Jun－mao1，*
(1.College of Food，Shihezi University，Shihezi 832003，China;
2.Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Beijing 100097，China)

To study the inhibitory action of anthocyanins from purple sweet potato(APSP)to TGEV in vitro，the sample of anthocyanins extract was purified and its structure was identified by HPLC－MS.The prepared anthocyanins extract was acting on disseminated TGEV in swine testicle cell，then research its influence on the morphological changes as well as apoptosis of ST cell and reveal its prevention and treatment on TGEV.The result showed that the extract of purple sweet potato contains eight major anthocyanins.When mass concentration of APSP was less than 60μg/mL，ST cell grow well without the cell toxicity.Introduced TGEV to ST，20μg/mL APSP could restrain the proliferation of TGEV after 48h and 72h cultivation，and inhibition effect was dose－response in the security concentration range.At the same time，it was obvious that there was better prevention effect than treatment effect in this study.In summary，APSP had very good antiviral efficacy for TGEV in 20～60μg/mL.

purple sweet potato;anthocyanin;ST cell;TGEV;MTT

TS201.4

A

1002－0306(2012)21－0349－04

2012－04－01 *通讯联系人

雷用东(1988－)，男，硕士研究生，研究方向:果蔬贮藏与加工。

国家自然科学基金资助项目(30972048)。