秦晓杰，许皎姣，索 娜，周海莲，何 洋，肖红梅

(南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095)

草莓灰霉病拮抗酵母菌的筛选鉴定及对采后草莓品质的影响

秦晓杰，许皎姣，索 娜，周海莲，何 洋，肖红梅*

(南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095)

从南京市马群草莓生产基地的草莓果实、叶片上分离筛选到一株对灰霉病具有明显抑制效果的拮抗酵母菌N1，结合生理生化特性及26S rDNA D1/D2区序列分析鉴定其为季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)。通过用不同浓度N1菌悬液处理打孔后的草莓，发现菌悬液浓度越高，抑制效果越好，最佳浓度为5×108CFU/mL，其病斑直径比对照组小了32.3%。拮抗菌N1处理后果实于(2±1)℃、相对湿度(RH)90%～95%下冷藏，结果表明，拮抗酵母N1菌对果实酸含量无显著影响，但能保持草莓果实的光泽和硬度，维持VC含量和可溶性固形物含量，并显著减小了失重率，提高了草莓的冷藏品质，从而显著延长草莓的贮藏寿命。由此推测，该拮抗酵母菌具有很好的商业应用前景。

草莓，生物防治，季也蒙毕赤酵母，灰葡萄孢

草莓营养丰富，素有“水果皇后”之称，但由于其组织娇嫩多汁，果皮很薄，因而在采收和贮运中易受到损伤和微生物侵染导致其腐烂变质［1］。其中由灰葡萄孢引起的灰霉病为草莓生产中最主要的病害之一［2］，严重时可使草莓采后损失达50%以上，这直接影响了生产者的利益，也限制了草莓的进一步发展。长期以来，控制草莓采后病害最有效的方法仍然是使用化学杀菌剂，然而，随着抗药性和农药残留［3］等问题的出现以及人们对环保意识的增强，利用拮抗微生物来控制草莓采后病害在世界各地日益普及。目前已经分离出许多具有拮抗作用的细菌、放线菌和酵母菌，而许多研究表明酵母菌是一种理想的生防制剂［4］，因为它具有能够附生在植物上面，对植物和人类没有致病性且能迅速增殖、遗传稳定、有较强抗逆性等优点，更容易被人们所广泛接受。如柠檬形克勒克氏酵母(Kloeckera apiculata)对柑橘的指状青霉(Penicillium digitatum)以及草莓和葡萄的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的腐烂［5－6］具有明显的防效;异常毕赤酵母(Pichia anomala)和橄榄假丝酵母(Candida oleophila)对香蕉的冠腐病［7］及苹果的灰霉病［8］生防效果较佳;膜醭毕赤酵母 (Pichia membranaefaciens)可防治桃子的褐腐病［9］等。为了更好的利用微生物资源进行果蔬采后病害防治，本实验从草莓及其叶片上分离到一株对草莓灰霉病有明显抑制作用的酵母菌N1，结合生理生化特性和26S rDNA D1/D2区序列比对，鉴定为季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)，研究了N1对采后草莓冷藏品质的影响，探索了该菌种在草莓采后贮藏保鲜中应用的可能性，以寻求一种理想、安全的方法控制草莓采后病害。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

“丰香”(Toyonoga)草莓 江苏省南京马群草莓种植基地;灰葡萄孢 分离自草莓果实。

YX280B型手提式不锈钢蒸汽消毒器 上海三申医疗器械有限公司;SW－CJ－ID型单人净化工作台

苏州净化设备有限公司;NIKON显微镜 日本尼康;BSA124－CW电子天平 赛多利斯有限公司;移液枪(100μL、1000μL) 北京金花;SPX－150B－Z型生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂; HZQ－F160型全温振荡培养箱 太仓市实验设备厂。

1.2 拮抗酵母菌的分离与筛选

1.2.1 拮抗酵母菌的分离纯化 将10g果实样品研磨成浆，叶片1～2片，分别加入100mL无菌水，在250r/min下充分振荡 30min，做梯度稀释(10－5～10－7)，各取100μL涂布于PAD平板上，28℃下培养2～3d，挑取特征各异的酵母菌单菌落，反复平板划线分离、纯化。

1.2.2 拮抗菌的筛选

1.2.2.1 离体筛选 平板对峙法:先将供试拮抗酵母菌株和病原菌分别进行平板活化，然后采取网格的方式用接种环将拮抗酵母菌株接入PDA平板，同时在PDA平板中央打孔接入培养了7d左右的灰霉菌，28℃下培养5～7d，测量灰霉的直径大小。每个处理3个平板，实验重复3次。

将上述有效的拮抗酵母菌株采用以上方法进行复筛。每个处理3个平板，实验重复3次。

1.2.2.2 活体筛选 在草莓果实腰部用用已灭菌的打孔器打1个直径为3mm(宽)×4mm(深)的孔，每孔注入20μL的5×108CFU/mL拮抗酵母菌悬液，以无菌生理盐水作为对照(CK)，2h后都接种20μL的5×105spore/mL病原菌孢子悬液，室温晾干后，果实放于一次性可降解塑料盒内，贮藏于25℃、RH 95%的恒温培养箱中。每组处理30个果实，3d后测定果实病斑直径，计算防治效果。

1.3 拮抗酵母菌鉴定

1.3.1 菌落性状与生理生化特征 将拮抗酵母菌接种于PDA平板上，28℃培养2d后观察它的生长特征和形态特征。参照文献［10］鉴定菌株的生理生化特征。

1.3.2 26S rDNA序列分析鉴定［11－12］酵母菌 26S rDNA通用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，进行序列测定并构建系统发育树。

1.4 不同浓度酵母菌液对草莓病斑直径的影响

拮抗酵母菌液浓度分别为 5×106、5×107、5×108、5×109CFU/mL。处理方法同1.2.2.2。实验重复3次。

1.5 拮抗酵母菌N1处理对草莓冷藏效果的影响将果实随机分成两组，一组浸渍5×108CFU/mL N1酵母菌悬液30s作为处理组，另一组浸渍生理盐水作为对照组，分别浸渍30s。室温晾干后，将果实放于一次性可降解塑料盒内，贮藏于(2±1)℃、RH 90%～95%下。每隔2d观察并测定品质指标。每处理500个果实，设3个平行，实验重复3次。

1.6 指标测定方法

1.6.1 病斑直径及防治效果 病斑直径采用十字交叉法测量［13］，防治效果(%)=(对照病斑直径－处理病斑直径)/对照病斑直径 ×100。每处理 30个果实。

1.6.2 贮藏寿命 草莓腐烂指数达15%或失重率达5%时定义为贮藏寿命结束。按下式计算草莓的贮藏寿命:贮藏寿命=Σ(草莓果实对应的贮藏天数×果实个数)/果实总个数。每处理40个果实。

1.6.3 失重率 采用称重法，失重率(%)=(果实原始质量－测量时质量)/原始质量×100。每处理40个果实。

1.6.4 硬度 采用GY－B型果实硬度计测定。每处理30个果实，取平均值。

1.6.5 可溶性固形物 采用手持折光仪测定。每处理30个果实，取平均值。

1.6.6 色泽 采用MINOLTA CR－200色彩色差仪测定果实表皮颜色的L*、a*和b*值，随机选取果实腰部平整处进行测定。每处理40个果实，取平均值。

1.6.7 酸含量 采用酸碱滴定法［14］测定。每处理30个果实，取平均值。

1.6.8 VC含量 采用碘滴定法［15］测定。每处理30个果实，取平均值。

1.7 数据处理与分析

实验数据处理采用 SAS软件进行处理，采用ANOVA方差分析和邓肯氏多重比较处理之间的差异显著性(p=0.05)。

2 结果与分析

2.1 筛选

2.1.1 离体筛选 将分离得到的85株菌通过网格平板对峙实验进行离体筛选，得到对灰霉病有显著抑制作用的酵母菌17株，其中显示出显著的抑制作用(p＜0.05)拮抗酵母菌为N1、PJ15、PJS5、PJS6、PJS9、 G5(见表1)。

2.1.2 活体筛选 将通过离体筛选得到的6株菌进行活体筛选。通过统计草莓的腐烂率和病斑直径，评价各株拮抗酵母菌对草莓灰霉病的抑制效果，结果见表2。从草莓上分离的N1、PJS6、PJS9在病斑直径及发病率上都显示出极显著的抑制作用(p＜0.05)，但PJS6、PJS9会在草莓打孔的伤口表面形成一层白色物质，影响外观。而N1处理下的草莓病斑直径为0.75cm，比CK组要小0.61cm，防治效果达到45%，对草莓灰霉病显示出较高的抑制效果。

表1 分离的拮抗菌对灰葡萄孢的抑制Table 1 Inhibition of Botrytis cinereaby the isolated microorganisms

表2 分离的拮抗菌对草莓灰葡萄孢的抑制Table 2 Inhibition of Botrytis cinerea of strawberries by the isolated microorganisms

2.2 拮抗酵母菌N1的鉴定

2.2.1 菌落性状与生理生化特征 酵母菌N1在PDA平板上形成的菌落(图1A)成圆形，乳白色，表面隆起，边缘整齐，直径2～4mm，表面无光泽，质地粘稠，有芳香味。菌体细胞(图1B)呈长椭圆形，出芽生殖，(3～10)μm×(1～4)μm(长×宽)。具体生理生化指标见表3。

综合分析酵母菌N1的形态特征和生理生化特征，参照J.A.巴尼特等［10］的鉴定方法，初步鉴定该酵母菌是季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)。

2.2.2 26S rDNA序列分析鉴定 将N1的测序结果在NCBI数据库中上进行同源性分析，并构建系统发育进化树(图2)。通过比对发现N1与季也蒙毕赤酵母HJM(Pichia guilliermondii strain HJM)、季也蒙毕 赤 酵 母 EXOC14B (P.guilliermondiistrain EXOC14B)的同源性为99%，结合2.2.1结果，初步确定 N1 菌株为季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)，在GenBank中登陆号为JX125041，电泳扩增结果如图3所示。

图1 拮抗酵母菌N1的形态特征Fig.1 The morphological characteristic of the antagonistic yeast N1

表3 酵母菌N1的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of N1 yeast strain

图2 基于26S rDNA D1/D2区序列构建的N1系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences of N1

图3 N1的PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification results of N1

2.3 不同浓度N1酵母菌液对草莓病斑直径的影响

如图4所示，使用N1酵母菌悬液处理草莓果实能有效抑制灰霉病病斑的扩展，减轻草莓果实的腐烂，且浓度越高抑制效果越好。其中，经5×108CFU/mL N1酵母菌悬液处理的草莓果实病斑直径为0.90cm，比对照组1.33cm小了32.3%，对灰葡萄孢有显著的抑制作用。而 5×108CFU/mL处理结果与5×109CFU/mL的相差不大，故选用5×108CFU/mL浓度作为最佳浓度，并用于后续实验中。

图4 不同浓度的N1酵母菌悬液对草莓果实灰葡萄孢发病病斑直径的影响Fig.4 Effects of different concentrations of N1 on strawberry fruit lesion development of Botrytis cineria infection

2.4 拮抗酵母菌N1处理对草莓冷藏效果的影响

2.4.1 冷藏期间草莓果实失重率、腐烂率变化 随着贮藏期的延长，处理组与对照组的失重率均有所增加，处理组草莓果实失重率显著低于对照组(p＜0.05)。对照组在冷藏9d后失重率开始大幅上升，在12d时已达到10.45%。而处理组冷藏前期果实保持较好，冷藏后期失重率才开始明显升高，冷藏至15d时，处理组果实和对照组果实的失重率分别为4.97%和16.38%(图5－A)。

对照组部分果实冷藏3d开始出现腐烂现象，表现为外表皱缩，颜色变暗，出现水斑，香气减少，部分果实霉变;而酵母菌悬液处理组只有个别果实表面有水斑现象，果实风味等感官良好，且无霉变出现，有较好的食用和商品价值，直到9d才有明显的腐烂现象。冷藏9d时，处理组和对照组腐烂指数分别为9.425%和14.65%。冷藏15d时，处理组果实和对照组的腐烂指数分别为15.55%和30.25%(图5－B)，有显著差异(p＜0.05)，此时的对照组大部分已经腐烂。当草莓腐烂率达15%或失重率达5%时定义为贮藏寿命结束，由此可知处理组和对照组草莓的贮藏寿命分别是14d和10d，拮抗酵母菌N1处理延长了草莓的贮藏寿命。

图5 冷藏期间草莓果实失重率(A)、腐烂率(B)的变化Fig.5 Changes in weight loss rate(A)，decay rate(B)during cold storage

2.4.2 冷藏期间草莓果实硬度和可溶性固形物变化 从图6－A中可以看出，贮藏期间果实硬度开始会有轻微上升，在贮藏9d后处理组和对照组开始出现差异，处理组草莓硬度较高且略有上升，直至12d时硬度开始下降;而对照组在贮藏9d后硬度开始下降，与处理组区别显著(p＜0.05)。冷藏12d时，处理组果实和对照组果实的硬度分别为2.29和1.58(图6－A)，这说明拮抗酵母菌N1较好地保持草莓的感官品质。整个贮藏过程中，处理组和对照组可溶性固形物含量总体均呈下降趋势，但对照组下降迅速而处理组变化很小，在冷藏6～9d处理组可溶性固形物略微上升波动。冷藏9d后两组可溶性固形物含量开始出现差异(图6－B)，对照组迅速下降而处理组开始上下波动。这说明酵母菌悬液处理能够在一定程度上保持草莓冷藏期间的可溶性固形物含量。

图6 冷藏期间草莓果实硬度(A)、可溶性固形物(B)的变化Fig.6 Changes in Firmness(A)，Soluble solids content(B)during cold storage

图7 冷藏期间草莓果实颜色L*、a*和b*值的变化Fig.7 Changes of fruit color (L*，a*and b*values)during cold storage

2.4.3 冷藏期间草莓果实色泽变化 由于草莓果实采摘时只有七八成熟，冷藏过程中，随着草莓果皮中叶绿素被分解和花青素积累，果实明度和颜色会有所变化。总的来说，从图7可以看出，对照组和处理组L*值均显出下降趋势，但处理组的效果较好，L*值下降缓慢。前6d处理组和对照组L*值基本保持不变，第9d开始产生分歧，对照组L*值开始随贮藏时间呈显著下降趋势，草莓颜色变暗，严重影响商品价值，处理组与空白组趋势一致，但变化较小(p＞0.05)。由此可见酵母菌悬液处理能在一定程度上保持草莓的光泽。处理组和对照组的a*和b*值差异不显著(p＞0.05)，均随贮藏时间延长逐渐增大，这说明果皮颜色逐渐转红转黄，酵母菌悬液处理对草莓果皮的颜色变化没有太大影响。

2.4.4 冷藏期间草莓果实酸含量和VC含量的变化由图8－A可知，在贮藏期间，酸含量总体呈下降趋势。处理组与对照组相比相差不大，这说明拮抗酵母菌并未显著提高草莓的风味。由图8－B可知，在贮藏期间，VC含量呈下降趋势。处理组的最大损失率为36.0%，小于对照组的43.3%，VC损失率较小。这说明拮抗酵母菌一定程度上保存了草莓的营养价值，但是并未产生显著效果。

图8 冷藏期间草莓果实可滴定酸含量(A)、VC含量(B)的变化Fig.8 Changes of content of titratable acid(A) and VC(B)during cold storage

3 结果与讨论

3.1 本实验主要是通过离体和活体结合进行拮抗酵母菌的筛选，在离体实验中N1防效要低于PJS9、PJ15、G5，但在活体实验时N1却表现出较好的拮抗效果，这可能由于在离体实验中，酵母菌占领营养和空间的速度低于病原菌菌丝的蔓延速度;但在果实伤口做拮抗实验时，酵母菌只要占领伤口的营养和空间就能有效控制病菌的生长。对于果蔬病害生防菌的筛选，一般都根据离体实验进行筛选［16］，但许多研究表明，平板筛选与其实际的拮抗效果可能没有必然的联系［17－18］，本实验就先通过离体实验筛选出拮抗效果较佳的6株菌，然后在草莓进行验证，最终得到了防效较好的拮抗酵母菌N1。

3.2 利用传统的生理生化特性分析结合26S rDNA D1/D2序列分析对拮抗酵母菌N1的分类地位进行了研究，确定N1为季也蒙毕赤酵母。季也蒙毕赤酵母在苹果、柑橘、梨、草莓［19－20］等水果用于抑制灰霉、青霉、绿霉、根霉等病害的防治已被广泛的报道，以往文献有几例草莓灰霉病生防菌筛的报道，但筛选到一株对草莓灰霉病具有明显防效的季也蒙毕赤酵母较少报道。

3.3 拮抗酵母菌N1菌悬液处理对草莓的冷藏品质有积极的作用，虽对草莓风味没有产生显著变化，但处理过的草莓贮藏寿命显著延长，失重率和腐烂率显著减小，果实硬度和可溶性固形物含量得到较好的维持，草莓果实也保持了较好的光泽。这可能是由于季也蒙毕赤酵母能够很好地定殖在草莓上面，分泌β－1，3－葡聚糖酶和几丁质酶等在内的胞外溶解酶来与病原菌争夺养分和空间［21］，控制果蔬的发病率，减少了腐烂率。Wisniewski等［22］证明了季也蒙毕赤酵母能够吸附在灰霉的菌丝细胞壁上，改变灰霉某些糖类和蛋白质的完整性。Zhao Yan和Dianpeng Zhang的研究也表明了季也蒙毕赤酵母能诱导寄主包括过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸氨(PAL)酶和β－1，3－葡聚糖酶等酶［23－24］的活性，这些酶［25］能够专一性的清除果蔬体内的活性氧或者阻止它们的产生，同时参与果蔬体内酚类物质、植保素、木质素等多种抗性物质的合成，从而延缓了果蔬硬度的下降，提高了抗病性，保证了果蔬的色泽及营养成分，最终起到保护果蔬的作用。

3.4 通过以上实验可以推测出该拮抗酵母菌具有很大的开发及应用前景。但本研究只是对拮抗酵母菌的筛选鉴定以及对冷藏品质的影响做了简单的研究，要真正应用于实践，达到化学防治的效果，还需要将其与其他外源物质结合处理，如壳聚糖、金属盐类、植物激素、氨基酸等［26－28］，以达到提高酵母菌防治效果的目的，这些还有待更加深入的研究，而关于田间防效及商业化产品开发也需要进一步的探索。

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Screening and identification of antagonistic yeast against the gray mould disease and effect on quality of postharvest strawberry

QIN Xiao－jie，XU Jiao－jiao，SUO Na，ZHOU Hai－lian，HE Yang，XIAO Hong－mei*
(College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)

The antagonistic yeast N1 with a high ability of inhibiting the gray mould(Botrytis cinerea)disease on strawberry was isolated from the strawberry fruits and leaves in Nanjing Maqun with in vitro and in vivo methods.This strain was preliminarily identified asPichia guilliermondiibased on the similarity analysis of its physiologicalbiochemical characteristics and 26S rDNA D1/D2 domain sequence.Pretreatment with different concentrations of N1 could decrease the incidence of rot on postharvest strawberry after inoculation with pathogenic fungiBotrytis cinerea.The result showed that the higher concentration of N1，the inhibition effect on the gray mould disease was better.The best inhibition concentration of N1 was 5×108CFU/mL which could decrease the incidence of rot to 32.3%，compared with rot only inoculating with pathogenic fungi.Postharvest strawberries treated with the antagonist were stored at(2±1)℃ with RH 90%～95%，the results showed that the antagonist treatment had little effect on acid content，but could maintain fruit luster，firmness，soluble solid and vitamin C content，also reduce weight loss rate remarkably and extend storage life.These results revealed a potential commercial application of N1 as an antagonist for controlling the fruit postharvest diseases.

strawberry;biological control;Pichia guilliermondii;Botrytis cinerea

TS205.9

A

1002－0306(2012)21－0330－07

2012－03－29 *通讯联系人

秦晓杰(1990－)，女，硕士研究生，研究方向:食品科学。

江苏省科技计划项目(BE2010385);国家大学生创新性实验计划项目(GJ0724);南京农业大学大学生创业项目(1008cy12)。