何伟峰，陈 萍，李春阳，张拥军，*，林李洁，郑鸯鸯，吴竞东

(1.中国计量学院生命科学学院，浙江杭州 310018;

2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014)

前处理条件对黑木耳膳食纤维测定的影响研究

何伟峰1，陈 萍1，李春阳2，张拥军1，*，林李洁1，郑鸯鸯1，吴竞东1

(1.中国计量学院生命科学学院，浙江杭州 310018;

2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014)

针对黑木耳膳食纤维的特性，采用AOAC推荐的酶－重量法和酶－化学法均没有考虑非蛋白氮，不能准确地测定黑木耳膳食纤维的含量。本文通过黑木耳中非蛋白氮的测定，对比AOAC Official Method 991.43法及该方法校正后对测定黑木耳膳食纤维的差异。首先以甲壳素为标样，测定其中的氨基糖回收率，确定微波消解样品成游离氨基糖的最佳条件为盐酸浓度8mol/L、盐酸用量8mL、消解第一阶段功率60W、消解60s，第二阶段功率100W、消解120s;在此条件下处理黑木耳样品后，参照AOAC 991.43法测定黑木耳膳食纤维含量时会造成3.18%的偏差。故测定含几丁质的食用菌类物质的膳食纤维时需对AOAC方法进行校正。

黑木耳，膳食纤维，前处理，检测

黑 木 耳Auriculariaauricula(L.exHook.)Underwood，属于担子菌纲，木耳目、木耳科、木耳属，为我国珍贵的药用和食用胶质真菌。我国是世界上生产黑木耳的主要国家，占世界黑木耳总产量的90%左右。黑木耳中总碳水化合物占子实体干重的70%以上，是一种优质的膳食纤维(dietary fibre，DF)来源。膳食纤维可分为水不溶性膳食纤维(insoluble dietary fibre，IDF)和水溶性膳食纤维(soluble dietaryfibre，SDF)两部分，黑木耳不溶性膳食纤维包括几丁质、纤维素、木质素等，可溶性部分包括甘露聚糖、葡聚糖、酸性多糖等［1］。此外，黑木耳膳食纤维还包括一些微量成分，如黑色素、酚类化合物等［2］。黑木耳作为一种优质的膳食纤维源，在开发利用过程中，准确的定量分析方法的建立是影响质量、工艺和生物利用率的重要指标。目前公认的测定方法主要有以下三种:ADF/NDF法(即酸性洗涤纤维法和中性洗涤纤维法)，PROSKY法以及 ENGLYST法。其中ADF/NDF法是洗涤剂法测纤维的代表，自80年代初至今该法没有得到更大发展;PROSKY法(AOAC法)为酶－重量法的代表，是目前公认测定TDF、SDF和IDF含量的方法;ENGLYST法是酶－化学法的代表，其值被用于英国的食品标签中。由于黑木耳膳食纤维有着特殊的化学组成，不仅含有植物纤维，还含有动物纤维(细胞壁的主要成分几丁质)，采用目前公认的几种膳食纤维测定方法都不能完全测定上述成分。Peter C－K Cheung［3］曾研究对比了采用酶－重量法和酶－化学法分别测定黑木耳膳食纤维的差别，发现采用酶－重量法法测定其总膳食纤维为(497 ±13)g/kg干重，酶－化学法为(421±11)g/kg干重，两法差别较大。目前关于黑木耳膳食纤维准确定量分析的研究还鲜有报道，本文通过黑木耳预处理方法的最佳条件摸索，获得了几丁质中的游离氨基糖，确定了氨基糖的最佳测定方法，以期得到黑木耳膳食纤维较为准确的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌床木耳(新科241)子实体 购自浙江富来森食品有限公司，置于50℃烘箱烘干，粉碎，筛选孔径为0.150～0.250mm的样品，备用;硅藻土Celite 545 AW，No.C8656 Sigma;铬酸洗涤液、MES－TRIS缓冲液、D－氨基葡萄糖盐酸盐、7%乙酰丙酮(3.5mL乙酰丙酮，溶于50mL 1.2mol/l碳酸钠溶液)、Ehrlich试剂(DMAB，1.333g DMAB溶于25mL无水乙醇及25mL浓盐酸的混合液)、乙醇、丙酮 均为分析纯。

粉碎机 江苏南京;AL04型电子天平 梅特勒－托利多有限公司;DHG－9240A型鼓风干燥箱 河南郑州;T6新世纪分光光度仪 北京;陶瓷纤维马福炉SX2系列、XT－9900型消解炉、KDY－9820型凯氏定氮仪 上海;膳食纤维测定系统，包括 CSF6、MULTISTIRRER6及GDE酶消化组件 意大利VELP SCIENTIFICA Co.。

1.2 实验方法

1.2.1 成分分析 粗脂肪含量:参照GB/T15674－2009;灰分含量:参照GB/T5009.4－2010;粗蛋白含量:参照GB/T15673－2009，其中总氮含量需要扣除氨基糖含量;总碳水化合物含量(%)=［100－(水分+粗蛋白质+灰分+粗脂肪)］%。

1.2.2 氨基糖的测定

1.2.2.1 标准曲线制作 以D－氨基葡萄糖盐酸盐作为标准品，参照Elson＆Morgan法［4］测定，即吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准溶液(100μg/mL)于25mL具塞试管中，补水至2mL，加入乙酰丙酮溶液1mL，沸水浴30min，冷却，加入2mL无水乙醇与1mL对二甲氨基苯甲醛试剂，振荡后，加入4mL无水乙醇，60℃水浴1h，冷却，在530nm处比色，根据所测得的吸光度及对应的糖质量绘制标准曲线。

1.2.2.2 前处理条件摸索 a.水解法与微波消解法对样品消解的影响:将0.10g甲壳素在6mL 6mol/L HCl下溶解16h，然后在100℃水解45min处理后采用Elson＆Morgan法测定氨基糖。同时取相等量的甲壳素加入6mL 6mol/L HCl，用微波消解仪消解，第一阶段功率60W消解60s，第二阶段功率100W消解120s，处理后采用Elson＆Morgan法测定氨基糖。

b.盐酸浓度对样品消解的影响:准确称取0.10g甲壳素4份于消化管，分别加入6、8、10、12mol/L HCl各6mL，用微波消解仪消解，第一阶段功率60W消解60s，第二阶段功率100W消解120s，处理后采用Elson＆Morgan法测定氨基糖。

c.盐酸用量对样品消解的影响:准确称取0.10g甲壳素7份于消化管，分别加入6mol/L盐酸2、3、4、5、6、7、8mL，用微波消解仪消解，第一阶段功率60W消解60s，第二阶段功率100W消解120s，处理后采用Elson＆Morgan法测定氨基糖。

d.微波消化时间对样品消解的影响:取0.10g甲壳素，加入6mL 6mol/L HCl，第一段水解时间固定为60s，分别控制第二段消解时间为60、90、120、150、180、210、240、270、300s，处理后采用Elson＆Morgan法测定氨基糖。

转化率计算公式:

氨基糖转化率(%)=W1/W2×100

其中，W1指消解后氨基糖含量(g)，W2指样品甲壳素重量(g)。

1.2.2.3 预处理工艺的因素水平确定 根据单因素预实验的最适条件范围，按照正交实验设计三个因素，即盐酸浓度、盐酸体积、消解时间，采用L9(34)因素与水平进行条件优化，见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.2.4 黑木耳中氨基糖的测定 样品经微波消解仪在最优条件下消解，然后用NaOH溶液中和消解液，再将消解液移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，混合均匀后，消解液经滤纸过滤，收集储存。取2.0mL过滤的消解液于带塞试管中，加入乙酰丙酮试剂1.0mL，沸水浴30min，冷却后，慢慢加入2.0mL无水乙醇，然后加入1.0mL DMAB，振荡均匀。再加入4.0mL无水乙醇，60℃下保温1h，以试剂空白为参比，在紫外分光光度计530nm处测定吸光度，并按标准曲线的方程求出黑木耳中氨基糖的含量，并折算成含氮量(N)。

1.2.3 膳食纤维的测定 准确称取(1.000±0.0020)g样品置于500mL烧杯中，加入40mL pH8.2的MESTRIS缓冲液，用磁力搅拌直到样品完全分散。参照AOAC Official Method 991.43，其中蛋白质的计算扣除氨基糖中的含氮量。总膳食纤维(TDF)与IDF均采用下式计算:

式中，X为TDF或IDF含量(%);R为残留物重量(mg);P1、P2和A分别为粗蛋白质、非蛋白氮、灰分重量(mg);M为样品的重量(mg)。

SDF(%)=TDF(%)－IDF(%)

2 结果与分析

2.1 黑木耳子实体的营养成分

黑木耳子实体中的主要营养成分见表2。

表4 盐酸浓度对样品消解的影响Table 4 Effect of hydrochloric acid concentration on sample dissolution

表5 盐酸用量对样品消解的影响Table 5 Effect of the amount of hydrochloric acid on sample dissolution

表6 消解时间对氨基糖转化率的影响Table 6 Effect of the microwave dissolution time to the conversion ratio of amino sugar

表2 黑木耳子实体的主要营养成分(以干物质计)Table 2 The main nutritional components of the Auricularia auricular(In dry matter)

由表2可知，黑木耳子实体的营养成分主要以碳水化合物以主，其次是蛋白质，还含有一定量的矿物元素及少量的脂肪类物质。其中碳水化合物的测定结果与Peter CK Cheung［3］的文章很相似。灰分的结果差异较大，原因较难推测，有可能是样品受到污染，或者样品灰化时不彻底，或者品种不同造成。另外，黑木耳中脂肪含量较低，进行膳食纤维测定时，可以不需要进行脱脂处理。

2.2 氨基葡萄糖标准曲线

根据测定结果，用excel进行拟合得D－氨基葡萄糖盐酸盐含量(μg/mL)与吸光度A间的回归方程:Y=0.0059X+0.014(R2=0.9961)结果见图1。

图1 D－氨基葡萄糖与吸光度间的线性关系Fig.1 The linear relationship between the absorbance and the D－glucosamine

2.3 氨基糖测定的最佳条件

2.3.1 水解法与微波消解法 两种方法测定结果见表3。

由表3可知，水解法和微波消解法处理样品后，测定氨基糖得率无明显差异。从处理后残渣观察，还存在一些淡黄色沉淀，说明两种处理方法都没有使样品充分的水解，与表中的实验数据相符。由于水解法耗时较长，以下实验选择微波消解法。

表3 两种预处理方法对样品消解的影响Table 3 Effect of two different pretreatments on sample dissolution

2.3.2 盐酸浓度对样品消解的影响 不同浓度盐酸(体积恒定)对甲壳素样品消解的结果见表4。

从表4可以看出，在料水比不变的情况下，加入8mol/L的盐酸，甲壳素水解最充分，测得氨基糖的转化率最高。盐酸浓度过高，容易造成样品炭化而使测定值偏低。

2.3.3 盐酸用量对样品消解的影响 不同用量盐酸(8mol/L)对甲壳素样品消解的结果见表5。

从表5可知，随着盐酸加入体积的增加，氨基糖含量值增加，当体积达到6mL，氨基糖的含量值达到较高值，并且随着盐酸体积增加基本保持平衡，说明此时盐酸体积已经不是消解的限制因素。

2.3.4 微波消解时间对样品消解的影响 不同消解时间甲壳素样品消解的结果见表6。

从表6可以看出，随着总消解时间(第一阶段为60s不变)的增加，氨基糖得率也增加，并在240s时达到最高值，时间再加长，氨基糖测定值反而下降。为微波消解仪不能直接控制消解温度，随着消解时间增长，消解管内温度过高，使样品炭化现象明显，造成损失。实验选取90、120、150s做正交实验。

2.3.5 微波消解最优条件确定 在上述单因素实验的基础上设计3水平3因素正交实验，实验结果见表7。

由表7可知，极差最大的为A因素，其次为B、C因素，说明A因素即盐酸浓度的改变对样品消解效果的影响最大，其次为盐酸用量、消解时间，综合各因素k值和直观比较得出最佳组合条件为A2B3C2。由于盐酸用量与消解时间对实验结果影响较小，从实际效果考虑，确定消解的最佳条件为:盐酸浓度8mol/L、盐酸用量8mL、消解时间120s。一步在以上优化条件下进行验证实验，共进行3次实验，所得结果平均为84%。因此，以下实验中氨基糖测定选择在此条件下对样品进行消解。

表7 正交实验结果Table 7 The result of orthogonal experiment

2.4 黑木耳膳食纤维的测定

参照AOAC Official Method，黑木耳膳食纤维的测定结果见表8。

表8 黑木耳膳食纤维的测定结果Table 8 The result of the dietary of Auricularia auricula

由表8可知，采用AOAC方法测定出的黑木耳膳食纤维的值低于校正后膳食纤维值，主要是由于AOAC方法中计算膳食纤维含量时，把按凯氏定氮法测定出的含氮量全都计算为蛋白质，没有考虑黑木耳中含有的几丁质中的含氮量。校正后黑木耳膳食纤维的含量与校正前相差3.18%。

3 结论

本文通过测定甲壳素中氨基糖回收率确定样品消解成游离氨基糖的最优条件。在实验中尝试不同的预处理方法，如煮沸法，但所需时间较长(需十几个小时)，而微波消解只需几分钟，操作方便，且氨基糖回收高，因此酶解前的样品预处理方式选用微波消解法。并进一步通过正交实验确定黑木耳膳食纤维测定的微波消解条件为，盐酸浓度8mol/L、盐酸用量8mL、消解第一阶段功率60W、消解60s，第二阶段功率100W、消解120s。

黑木耳中脂肪含量较低(小于3%)，进行膳食纤维测定时，不需要石油醚进行脱脂处理。由于黑木耳中含量一定量的氨基糖，直接参照AOAC方法测定膳食含量时会造成3.18%的偏差，因此测定时需对AOAC方法进行校正。

［1］Valentine A Aletor.Compositional studies on edible tropical species of mushrooms［J］.Food Chemistry，1995，54(3): 265－268.

［2］WuQin，TanZhiping，LiuHaidan，etal.Chemical characterization ofAuricularia auriculapolysaccharides and its pharmacological effect on heart antioxidant enzyme activities and left ventricular function in aged mice［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2010，46:284－288.

［3］Peter CK Cheung.Dietary fibre content and composition of some edible fungi determined by two methods of analysis［J］.J Sci Food Agric，1997，73:255－260.

［4］McCleary B V，Bouhet F，Driguez H.Measurement of aminoglucoside using p－nitrophenyl b－maltoside as substrate［J］.Biotechnology Techniques，1991(5):255－258.

Study on the effect of different pretreatment condition to the determination ofauricularia auriculadietary fiber

HE Wei－feng1，CHEN Ping1，LI Chun－yang2，ZHANG Yong－jun1，*，LIN Li－jie1，ZHENG Yang－yang1，WU Jing－dong1
(1.College of Life Sciences，China Jiliang University，Hangzhou 310018，China;
2.Institute of Processing Agriculture Product，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China)

For the problem of the nitrogen element in the aminoglycoside molecule in the cell wall ofAuricularia auricular，it was not accurate to determine the contents of total dietary fiber ofauricularia auriculasamples by enzyme－weighted method and enzyme－chemical method by AOAC directly，without considering the non－protein nitrogen.The non－protein nitrogen in theauricularia auriculasamples were determined in this paper，and the difference on the determinationauricularia auriculadietary fiber was compared between AOAC official method 991.43 and its correction method.Firstly，the optimum condition to determine the recovery of aminoglycoside in chitin was gained，first stage was 60W and 60s，and second stage was 100W and 120s，upon the condition of 8mol/L and 8mL HCl at microwave digestion method.The result showed that there would be 3.18%deviation with AOAC official method 991.43 directly，and the correction to AOAC official method was necessary at the determination of edible fungi dietary fiber with chitin.

Auricularia auricular;dietary fiber;pretreatment;detection

TS207.3

A

1002－0306(2012)21－0305－04

2011－12－26 *通讯联系人

何伟峰(1990－)，男，本科生，研究方向:食品检测。

浙江省自然科学基金项目(Y3100539);浙江省科技创新团队项目(2010R50028);浙江省食品质量安全与检测实验教学中心项目;浙江省大学生创新活动计划(新苗人才计划，2012R409048)。