吴泽青，帅 欧，林 励，*，邱戊盛，欧先涛，吴攀创

(1.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006;

2.广东万年青制药有限公司，广东汕头 515064)

HPLC法同时测定不同品种溪黄草中3种三萜类成分的含量

吴泽青1，帅 欧1，林 励1，*，邱戊盛2，欧先涛2，吴攀创2

(1.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006;

2.广东万年青制药有限公司，广东汕头 515064)

目的:建立同时测定溪黄草中科罗索酸、齐墩果酸及熊果酸含量的高效液相色谱法。方法:采用Synergi 4u Fusion RP 80A C18(250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex company)色谱柱;流动相:甲醇(A)－0.2%磷酸水(B)(V∶V= 9∶1);等度洗脱;流速:0.6mL·min－1;检测波长:210nm;柱温30℃。结果:科罗索酸、齐墩果酸及熊果酸分别在0.111～1.111mg/mL(r=0.9999)、0.026～0.256mg/mL(r=0.9999)、0.307～3.067mg/mL(r=0.9999)范围内线性关系良好，平均回收率分别为97.72%、97.08%和97.46%(n=6)，RSD分别为1.24%、1.62%和1.25%。结论:本法快速、简便、准确，重复性好，可用于溪黄草3种主要成分定量分析和质量控制。

溪黄草，三萜，高效液相色谱法，测定

中药溪黄草为民间习用草药，用于治疗湿热泻痢，跌打瘀肿，急性黄疸型肝炎，急性胆囊炎等疾病［1］，临床使用广泛。溪黄草具有保肝抗癌等作用，溪黄草中的科罗索酸和2α，19－二羟基熊果酸具有体外抗乙肝病毒的作用，熊果酸类成分具有显著的抑制乙肝病毒作用［2－4］。溪黄草为岭南特色药材，在广东各地临床应用普遍，并出现以之为主要原料的保健产品，如溪黄草茶、溪黄草颗粒等，溪黄草在保健品开发方面具有较大潜力，但尚无较全面的相关质量标准对其药材及产品进行规范。目前市场上作

“溪黄草”入药的原植物有线纹香茶菜Rabdosia Iophan－thoides(Buch.－Ham ex D.Don)Hara.及同属植物狭基线纹香茶菜R.lophanthoides var.gerardiana(Benth.)Hara.、纤花香茶菜R.lophanthoides var.graciliflora(Benth.)Hara.和溪黄草R.serra(Maxim.) Hara.或R.lasiocarpa(Hayata)Hara.［5－6］。溪黄草含萜类、黄酮类、酚类、氨基酸等多种化学成分。目前对于溪黄草中三萜类成分含量测定的文献多集中在齐墩果酸［7］、熊果酸［8］、科罗索酸［9－10］等成分。尚未见同时测定四种不同基源的溪黄草多种三萜类成分含量的文献报道，本工作采用高效液相色谱法(HPLC)对四种不同基源溪黄草三萜类成分含量进行研究，为进一步提高溪黄草药材的质量标准研究水平提供科学依据。

表1 线性关系考察结果Table 1 Results of linear relationship

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

溪黄草药材 由广东万年青制药有限公司提供，并经广州中医药大学中药学院林励研究员鉴定为线纹香茶菜Rabdosia Iophanthoides(Buch.－Ham ex D.Don)Hara.、狭基线纹香茶菜Rabdosia lophanthoides var.gerardiana(Benth.)Hara.、纤花香茶菜Rabdosia lophanthoides var.graciliflora(Benth.)Hara.和溪黄草Rabdosia serra(Maxim.)Hara.;齐墩果酸、科罗索酸、熊果酸对照品 购自曼思特生物科技有限公司，批号分别为:MUST－09071701、MUST－10021301、MUST－10111201，纯度≥98%;乙腈 色谱纯，默克公司;磷酸 天津科密欧化学试剂厂，优级纯;甲醇、氯仿、盐酸 广州化学试剂厂，分析纯;水为超纯水;微孔滤膜 天津津腾公司。

Waters e2695一体机、Waters 2998 PDA检测器

Waters公司;8002型电热恒温水浴锅 上海市精慧仪器公司;XS 225A型分析天平 Sartorius公司; DFT－200型手提式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为 Synergi 4u Fusion RP 80A C18(250mm × 4.6mm，5μm，Phenomenex company);流动相:甲醇(A)－0.2%磷酸水(B)(V∶V =9∶1);流速0.6mL·min－1;检测波长:210nm;柱温: 30℃;进样量:10μL。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取五氧化二磷干燥24h以上的科罗索酸、齐墩果酸及熊果酸对照品适量，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL分别含科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸111.11、25.56、306.67μg的混合对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 取溪黄草药材适量，粉碎，过二号筛，精密称取4.0g，置150mL圆底烧瓶中，精密加入氯仿100mL，称定重量，回流提取1h，过滤，取滤液真空浓缩，残渣用甲醇分次溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.2.4 系统适用性实验 分别吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入色谱仪，按上述色谱条件测定。在此条件下科罗索酸、齐墩果酸及熊果酸峰与样品中其它成分峰均能达到基线分离。三成分与相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，理论塔板数均大于3000。

2 结果与分析

2.1 HPLC色谱图

四种溪黄草HPLC色谱图如图1所示。

2.2 标准曲线的制备

图1 四种溪黄草HPLC色谱图Fig.1 Chromatograms of four kinds of Linearstripe Rabdosia Herb

精密吸取混合对照品溶液2、6、10、12、16、20mL，分别置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别精密吸取10μL，按1.2.1的色谱条件进样分析，以各自的峰面积积分值Y为纵坐标，浓度X(mg·mL－1)为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程及线性范围见表1。

2.3 精密度实验

在上述色谱条件下，精密吸取混合对照品溶液连续测定6次，进样量为10μL，测定峰面积，结果见表2，科罗索酸、齐墩果酸及熊果酸峰面积RSD分别为1.52%、1.17%、0.75%，表明精密度良好。

2.4 重复性实验

精密称取同一样品(狭基线纹香茶菜1批)6份，按1.2.3的方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，测得溪黄草样品中科罗索酸、齐墩果酸及熊果酸峰面积RSD分别为0.75%、1.22%、0.90%，结果表明方法重现性良好，见表3。

2.5 稳定性实验

在上述色谱条件下，取同一样品(狭基线纹香茶菜1批)，分别于0、2、4、6、12、24h测定，测得溪黄草药材样品中科罗索酸、齐墩果酸及熊果酸峰面积RSD分为1.27%、1.54%、1.36%。结果表明样品在24h内稳定，见表4。

2.6 加样回收率实验

取同一批已知科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸含量的供试品(科罗索酸含量0.3820mg/g，齐墩果酸含量0.0993mg/g，熊果酸含量1.1582mg/g)，平行6份，每份取样量约2g，精密称定。按当前取样含量约1∶1精密加入科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸对照品，照1.2.3的方法制备供试品溶液。进样测定，计算回收率，结果见表5～表7，科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸平均回收率分别为97.72%、97.08%、97.46%，RSD分别为

表2 精密度实验结果Table 2 Results of precision test

表3 重复性实验结果Table 3 Results of repeated test

表4 稳定性实验结果Table 4 Results of stability test

表5 科罗索酸加样回收实验结果Table 5 Results of the recovery test of Corosolic acid

表6 齐墩果酸加样回收实验结果Table 6 Results of the recovery test of Oleanolic acid

表7 熊果酸加样回收实验结果Table 7 Results of the recovery test of Ursolic acid

1.24%、1.62%、1.25%。表明方法的准确度较好。

2.7 样品含量测定

分别取待测样品，按1.2.3的方法制备供试品溶液，在1.2.1色谱条件下，进行样品含量测定，结果见表8。

3 结论

本法快速、简便、准确，重复性好，可用于溪黄草药材3种主要成分定量分析和质量控制。不同基源的溪黄草药材科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸含量有所不同。四种药材中科罗索酸含量由高到低顺序排列分别为溪黄草、线纹香茶菜、狭基线纹香茶菜及纤花香茶菜;齐墩果酸含量由高到低顺序排列分别为溪黄草、线纹香茶菜、狭基线纹香茶菜及纤花香茶菜;熊果酸含量由高到低顺序排列分别为狭基线纹香茶菜、纤花香茶菜、线纹香茶菜及溪黄草。

表8 四种溪黄草含量测定结果Table 8 Results of contents of Linearstripe Rabdosia Herb

［1］江苏新医学院.中药大辞典(下册)［M］.上海:上海人民出版社，1977:2511.

［2］胡英杰，赖小平，刘中秋，等.狭基线纹香茶菜(溪黄草)的化学成分与抗乙肝病毒作用研究［J］.中草药，2005，36(11): 1612－1615.

［3］谢春英.溪黄草提取物预防大鼠急性肝损伤的实验研究［J］.中药材，2007，30(12):1582－1583

［4］刘银花，陈秀琴，沈婕，等.溪黄草配伍虎杖煎剂对大鼠实验性肝损伤的保护作用［J］.时珍国医国药，2008，19(2): 334－335.

［5］陈建南，赖小平，刘念.广东溪黄草药材的原植物调查及商品鉴定［J］.中药材，1996，19(2):73－74.

［6］赖小平，陈建南，陈林奴，等.中药溪黄草的研究进展［J］.广州中医学院学报，1995，12(4):56－58.

［7］刘凡.溪黄草的生药学研究［D］.广州:广州中医药大学，2010:47－53.

［8］李楚源，邓乔华，黄琳，等.溪黄草中熊果酸含量测定方法学研究［J］.中外医疗，2009(28):155－156.

［9］吴剑锋，刘斌，祝晨蔯，等.不同采收期溪黄草中2α－羟基熊果酸含量的动态研究［J］.中草药，2004，31(1):81－83.

［10］吴剑锋，刘斌，祝晨蔯，等.不同施肥区域溪黄草中2α－羟基熊果酸含量的比较［J］.药学进展，2004，28(7):318－321.

HPLC simultaneous determination of three triperpenoids components in Linearstripe Rabdosia Herb from different species

WU Ze－qing1，SHUAI Ou1，LIN Li1，*，QIU Wu－sheng2，OU Xian－tao2，WU Pan－chuang2
(1.School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medcine，Guangzhou 510006，China;
2.Guangdong Enterlife Pharmacy Company Limited，Shantou 515064，China)

Objective:To establish an HPLC method for simultaneous determination of 2α－hydroxy－ursolic acid，oleanolic acid and ursolic acid in Linearstripe Rabdosia Herb from different species.Methods:The HPLC system consisting of Synergi 4u Fusion RP 80A C18column(250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex company)and a solution system of methanol－phosphoric acid(V∶V=9∶1)as the mobile phase with isocratic elution was adopted.The flow rate was set at 0.6mL·min－1，the detection wavelength was 210nm and the column temperature was 30℃.Results: The linear ranges of 2α－hydroxy－ursolic acid，oleanolic acid and ursolic acid were 0.111～1.111mg/mL(r=0.9999)，0.026～0.256mg/mL(r=0.9999)，0.307～3.067mg/mL(r=0.9999)respectively.Conclusion:The average recoveries(n =6)were 97.72%(RSD=1.24%)，97.08%(RSD=1.62%)，97.46%(RSD=1.25%)respectively.The method was quick，simple and accurate with good reproducibility and could be used for determination and quality control of the three main components in Linearstripe Rabdosia Herb.

Linearstripe Rabdosia Herb;triperpenoids;HPLC;determination

TS218

A

1002－0306(2012)21－0296－04

2012－04－23 *通讯联系人

吴泽青(1988－)，女，硕士研究生，研究方向:中药资源开发与新药研究。