周丽萍，杨瑞华，张 悦，*

(1.黑龙江省科学院自然与生态研究所，黑龙江哈尔滨150040; 2.黑龙江省农业科院园艺分院，黑龙江哈尔滨 150040)

响应面法优化研磨珠辅助超声波萃取苹果多酚的工艺研究

周丽萍1，杨瑞华2，张 悦1，*

(1.黑龙江省科学院自然与生态研究所，黑龙江哈尔滨150040; 2.黑龙江省农业科院园艺分院，黑龙江哈尔滨 150040)

采用研磨珠辅助法萃取苹果多酚，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化萃取工艺。结果表明，研磨珠辅助萃取苹果多酚的最佳工艺条件为:超声时间23min，超声温度50℃，超声功率244W，珠加载量(珠∶料，g/g)1.25∶1，在此条件下苹果多酚得率为1.031mg/g。研磨珠辅助萃取与传统的超声波萃取法比较，苹果多酚得率提高了33.68%。

响应面，苹果多酚，萃取，研磨珠

苹果多酚(Apple polyphenol)是苹果中所含多元酚类物质的统称，是具有苯环并结合多个羟基化学结构的总称，是一类成份复杂的混合物。近年来大量研究显示，苹果多酚具有抗癌、抗氧化、抗动脉硬化、保护软骨与增强骨质、生发乌发、保护视网膜、抑菌、抗视力退化、抗过敏、防龋齿、防辐射、防治冠心病与中风等多种药理功能，其中抗氧化能力是VE的5倍、VC的20倍［1－3］，且在一定剂量范围内是安全、无毒的［4］，所以苹果多酚将成为未来最具潜力的保健品。提取是有效成分分析和研究的基础，所以选择适当的提取方法，不但可以提高目标产物的得率，而且可以节约能源，收到事半功倍的效果。因此，研究并优化植物有效成分的提取工艺十分必要。超声提取法是应用超声波强化提取植物的有效成分，是利用超声的空化效果从而破坏细胞壁结构，使其在瞬间破裂，植物细胞内的有效成分得以释放、直接进入溶剂并充分混合，从而提高目标产物的得率。苹果多酚主要存在于细胞壁中，普通的浸提方法很难全部溶出，本文研究在溶液中加载研磨珠来提高超声空化效果，从而提高苹果多酚得率，通过响应面优化研磨珠辅助超声波萃取苹果多酚的最佳工艺，一方面可以为苹果多酚的进一步研究奠定基础，同时也可为其它植物酚类的提取提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

国光苹果(Malus pumila cv.Ralls) 购于哈尔滨哈达果品批发市场;没食子酸、甲醇、无水乙醇、丙酮、钨酸钠、钼酸钠、溴水、硫酸锂、无水碳酸 均为分析纯。

KQ－5200超声波破碎仪 北京益植康生物科技有限公司;T6紫外可见分光光度计 北京普析通用公司;R－205B旋转蒸发仪 上海申胜仪器公司;循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司; JA2003电子天平 上海精科厂。

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理 国光苹果(Malus pumila cv.Ralls)，将苹果清洗干净，快速切成薄片漂烫灭酶，真空干燥箱40℃烘干，粉碎，放入－20℃冰箱中备用。

1.2.2 研磨珠辅助萃取苹果多酚的单因素实验

1.2.2.1 溶剂的选择 精确称取22份1.00g的苹果粉置于100mL烧杯中，按液固比50∶1(mL/g)分别加入浓度为40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇、丙酮和甲醇的水溶液和水，置于超声波破碎仪中，在常温、150W功率条件下提取20min，按照

1.2.4中方法测定、计算不同溶剂条件下提取液中多酚得率。

1.2.2.2 研磨珠加载量对苹果多酚得率的影响 精确称取5份1.00g的苹果粉置于100mL烧杯中，按液固比50∶1加入90%丙酮作为提取剂，然后分别按珠料比4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1(g/g)加入直径为3～4mm研磨珠，置于超声波破碎仪中，在常温、150W功率条件下提取20min，按照1.2.4项下方法测定、计算不同研磨珠加载量条件下提取液中多酚得率。

1.2.2.3 研磨珠直径对苹果多酚得率的影响 精确称取3份1.00g的苹果粉于100mL烧杯中，按液固比50∶1加入90%丙酮作为提取剂，然后按研磨珠加载量珠料比为1∶1分别加入直径为1～2mm、3～4mm、5～6mm的研磨珠，置于超声波破碎仪中，在常温、150W功率条件下提取20min，按照1.2.4项下方法测定、计算不同研磨珠直径条件下提取液中多酚得率。

1.2.2.4 固液比对研磨珠法萃取苹果多酚得率的影响 精确称取6份1.00g的苹果粉于100mL烧杯中，按研磨珠加载量珠料比为1∶1加入直径为5～6mm的研磨珠，然后分别按液固比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1加入90%丙酮，置于超声波破碎仪中，在常温、150W功率条件下提取20min，按照1.2.4中方法测定、计算不同固液比条件下提取液中多酚得率。

1.2.2.5 超声时间对研磨珠法萃取苹果多酚得率的影响 精确称取6份1.00g的苹果粉于100mL烧杯中，按液固比50∶1加入90%丙酮作为提取剂，然后按研磨珠加载量珠料比为1∶1加入直径为5～6mm的研磨珠，置于超声波破碎仪中，在常温、150W功率条件下分别提取10、20、30、40、50、60min，按照设定的时间取出提取样品，按照1.2.4中方法测定、计算不同超声时间条件下提取液中多酚得率。

1.2.2.6 超声温度对研磨珠法萃取苹果多酚得率的影响 精确称取7份1.00g的苹果粉于100mL烧杯中，按液固比50∶1加入90%丙酮作为提取剂，然后按研磨珠加载量珠料比为1∶1加入直径为5～6mm的研磨璃珠，置于超声波破碎仪中，分别按30、35、40、45、50、55、60℃温度，在 150W 功率条件下提取20min，按照1.2.4中方法测定、计算不同超声温度条件下提取液中多酚得率。

1.2.2.7 超声功率对研磨珠法萃取苹果多酚得率的影响 精确称取7份1.00g的苹果粉置于100mL烧杯中，按液固比50∶1加入90%丙酮作为提取剂，然后按研磨珠加载量珠料比为1∶1加入直径为5～6mm的研磨珠，置于超声波破碎仪中，分别按100、150、200、250、300、350、400W功率，在50℃温度条件下提取20min，取出各功率条件下提取的样品，按照1.2.4中方法测定、计算不同超声功率条件下提取液中多酚得率。

1.2.3 提取工艺最优参数的确定 在单因素实验时，按照工艺优化实验设计的因素水平条件进行研磨珠辅助萃取，提取结束后取出样品，将提取液用循环真空泵抽滤，取上清液测定多酚含量。以多酚得率作为评价指标进行研究和分析，以影响研磨珠辅助超声波萃取多酚的最主要四个指标为因素，确定四因素四水平的最佳参数进行响应面分析［5］。实验中的水平及编码见表1。1.2.4 多酚含量测定 采用Folin－酚法［6－9］测定苹果中多酚的含量。准确称取0.110g没食子酸，先加入少量蒸馏水待没食子酸完全溶解后，加入蒸馏水定容至1000mL，混合均匀得浓度为100μg/mL的没食子酸标准液。量取该标准溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.2mL置于10mL比色管中，加蒸馏水5mL，摇匀后加1.0mL福林－酚试剂，4min后加入3.0mL质量分数为7.5%的碳酸钠溶液，25℃水浴条件下保持2h，测定溶液在765nm波长处的吸光值(A765)。进行3组平行实验，以吸光度为纵坐标，没食子酸含量(μg)为横坐标，绘制标准曲线。样品测定按照上述方法操作，苹果总多酚含量以每g样品中没食子酸当量计。计算公式如下:

表1 响应面实验因素水平编码表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

式中:C:由标准曲线求得的含量(μg);m:样品质量(g);v1:样品定容的总体积(mL);v2:测定时吸取的样品体积(mL)。

2 结果与分析

2.1 多酚标准曲线方程

通过福林酚法，以吸光度值与没食子酸含量(μg)回归得标准曲线方程为:y=0.1961x－0.1929，R2=0.9992。

2.2 研磨珠辅助萃取苹果多酚的单因素实验结果

2.2.1 溶剂对苹果多酚得率的影响 不同溶剂对苹果多酚得率的影响结果见图1。

图1 不同溶剂对多酚得率的影响Fig.1 Effect of different solvent on polyphenol yield

单纯的有机溶剂和水作为提取剂，苹果多酚得率均很低，这是由于水分子可破坏多酚分子间的氢键、减弱多酚间的缔合能力，有助于多酚物质的溶出，因此，通常采用水－有机溶剂体系提取植物多酚。90%丙酮水溶液作为提取剂时，总酚得率最高，因此，确定单因素最佳溶剂为体积分数90%丙酮水溶液。

2.2.2 研磨珠加载量对苹果多酚得率的影响 由图2可见，随着研磨珠加载量的减少提取物中酚类物质含量增加，当珠加载量为1∶1时，苹果多酚得率达到最大值，而珠加载量为0时，Ralls苹果提取物中各酚类物质含量和总抗氧化能力下降极为显著。当研磨珠加载量为1∶1时，与不添加研磨珠比较，苹果多酚得率提高了33.68%。说明通过加载研磨珠辅助萃取，确实可以增加超声空化效果，提高目标产物得率，结合实验结果确定研磨珠加载量的单因素最佳条件为1∶1(g/g)。

图2 研磨珠加载量对多酚得率的影响Fig.2 Effect of grind balls load on polyphenol yield

2.2.3 研磨珠直径对苹果多酚得率的影响 由图3可见，随着研磨珠直径的加大，苹果多酚得率增大，当珠直径为5～6mm时，苹果多酚得率最高，由于实验采用的珠最大直径为5～6mm，结合实验结果，因此确定单因素最佳珠直径为5～6mm。

图3 研磨珠直径对多酚得率的影响Fig.3 Effect of grind balls’s diameter on polyphenol yield

2.2.4 液固比对研磨珠法萃取苹果多酚得率的影响 由图4可见，当液固比到50∶1时，苹果多酚得率较高，且继续增加液固比在60∶1～70∶1范围内时，多酚得率基本不变。综合经济成本及后续浓缩处理等因素的考虑，确定液固比单因素的最佳条件为50∶1。

2.2.5 超声时间对研磨珠法萃取苹果多酚得率的影响 由图5可见，超声波作用时间对苹果多酚得率具有显著的影响。当超声波作用时间为20min时多酚得率达到最高，然后随着超声波作用时间的延长，多酚得率下降，这可能是因为超声时间过长，产生自由基，使溶出的多酚类物质又被氧化所致。所以超声波提取时间单因素实验结果确定为20min比较适宜。

图4 液固比对多酚得率的影响Fig.4 Effect of ratio of liquid to material on polyphenol yield

图5 超声时间对多酚得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic time on polyphenol yield

2.2.6 超声温度对研磨珠法萃取苹果多酚得率的影响 由图6可见，当温度在30～50℃之间时，随温度升高多酚得率增加，并且在50℃时达到最大值，当继续升高温度，苹果多酚得率随之下降，这可能是由于温度过高酚羟基容易被氧化。所以确定单因素最佳超声温度为50℃。

图6 超声温度对多酚得率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on polyphenol yield

2.2.7 超声功率对研磨珠法萃取苹果多酚得率的影响 由图7可知，超声波功率在100～250W时，随着功率的增大，苹果多酚得率增加，功率为250W时苹果多酚得率达到最大值，继续增大超声波功率到300～400W时，苹果多酚得率随之下降，因此，选择250W为最佳超声波功率。

2.3 响应面优化研磨珠辅助萃取苹果多酚工艺

2.3.1 实验设计及结果 根据Box－Benhnken的中心组合设计原理，以单因素实验结果为基础，并选取超声温度、超声时间、超声功率及研磨珠加载量4个因素为实验因子，以总酚得率为响应值设计响应面实验，以优化研磨珠萃取法萃取苹果多酚的提取工艺。利用Minitab7.0软件进行4因素响应面实验设计，共27组实验，各组实验设计及多酚得率结果见表2。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

图7 超声功率对研磨珠法萃取苹果多酚得率的影响Fig.7 Effect of ultrasonic power on polyphenol yield

2.3.2 响应面结果分析 将各组实验数据输入Minitab软件分析程序进行回归拟合，可得到响应值Y和各因子(X1、X2、X3、X4)之间的二次多元方程: Y=0.999+0.120X1+0.0123X2－0.0146X3+0.0550X4－0.250X12－0.0568X22－0.0717X32－0.139X42－0.0005X1X2+0.0060X1X3+0.0487X1X4+0.0087X2X3－0.0103X2X4－0.0210X3X4。响应面回归显著性分析见表3。

表3回归方差分析显著性检验表明，该模型回归显著(p＜0.0001)，失拟项不显著，并且该模型R2=0.9348，R=0.8586，说明该模型与实际实验拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于苹果多酚提取工艺实验的预测。

方差分析结果还表明，方程的一次项中，超声时间(X1)和研磨珠加载量(X4)对苹果多酚得率影响极显著;二次项中，超声时间(X1)和研磨珠加载量(X4)对多酚得率影响差异极显著，而超声温度(X2)和超声功率(X3)的平方项对多酚得率影响差异显著。由此可见，各具体实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

表2 响应面实验设计与结果Table 2 Results of response surface experiments

各因素的影响程度分析，各因素的F值可以反映出各因素对实验指标的重要性，F值越大，表明对实验指标的影响越大，即重要性越大。从方差分析表可知:FX1=50.38，FX2=0.729，FX3=0.74，FX4= 10.57，即各因素对苹果多酚提取率的影响程度大小顺序为:超声时间＞研磨珠加载量＞超声功率＞超声温度。

2.3.3 各因素之间的交互作用 在各因素交互作用分析中，由表3可以看出，各因素交互作用影响均不显著(p＞0.05)。根据回归方程，做出响应面分析图(图8)，考察所拟合的响应曲面的形状，分析超声时间、超声温度、超声功率、研磨珠加载量对苹果多酚提取率的影响。

图8 响应曲面图Fig.8 Response surface

2.3.4 优化工艺结果 通过Matlab7.0软件，对响应面优化工艺结果拟合分析得最佳提取工艺为:超声时间 22.62min，超声温度 50.38℃，超声功率243.85W，珠加载量1.25∶1。响应面模型在此条件下对多酚得率的预测值为1.023mg/g。为进一步验证，采用确定的优化条件进行三次平行实验，同时考虑到实际操作的情况，将多酚得率的最佳条件修正为:超声时间23min，超声温度50℃，超声功率244W，珠加载量1.25∶1。结果显示平均多酚提取得率为1.031mg/g，与理论预测值比较误差为0.7%，说明实验结果与模型符合良好，并达到实验过程中的最高得率，说明此响应面模型具有可行性。因此，采用响应面优化得到的研磨珠辅助萃取苹果多酚提取工艺条件准确可靠，具有实用价值。

3 结论与讨论

响应面优化研磨珠辅助萃取苹果多酚的最佳工艺条件为:溶剂为体积分数90%丙酮水溶液，液固比为50∶1，超声时间23min，超声温度50℃，超声功率244W，珠直径为5～6mm，珠加载量1.25∶1(g/g)，在此条件下苹果多酚得率为1.031mg/g。单因素结果表明，当研磨珠加载量为珠∶料=1∶1(g/g)时，与不添加研磨珠比较，苹果多酚得率提高了33.68%。响应面结果显示研磨珠加载量对苹果多酚得率的影响极其显著，这也说明玻璃珠的加入确实可以辅助提高超声波的空化效果，提高目标产物的提取率。

植物多酚的提取方法一般采用超声波提取法，有研究表明超声波法可以有效的提取苹果中的多酚成分［10－12］。而本文通过在溶液中加入研磨珠来辅助超声波法提取苹果多酚，结果表明要优于单纯的超声波法。研磨珠辅助萃取苹果多酚工艺的建立，不但可提高苹果多酚的得率，同时也可为其它植物有效成分的提取提供借鉴。

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Optimization of apple polyphenols extraction with grind balls by response surface methodology

ZHOU Li－ping1，YANG Rui－hua2，ZHANG Yue1，*
(1.Institute of Natural and Ecology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150040，China;
2.Horticulture Branch，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150040，China)

The response surface methodology based on single factor experiment was used to optimize processing parameters of extraction with grind balls for apple polyphenols.Results showed that the optimal processing conditions of ultrasonic extraction were ultrasonic time 23min，extraction temperature 50℃ and ultrasonic power 244W，balls to material ratio 1.25∶1.The yields of apple polyphenols under the optimal extraction conditions were up to 1.031mg/g and 33.68%increased comparing with traditional ultrasonic extraction method.

response surface method;apple polyphenols;extract;grind balls

TS201.1

B

1002－0306(2012)21－0277－05

2012－03－29 *通讯联系人

周丽萍(1976－)，女，硕士，助理研究员，研究方向:植物活性成分。