马微微，陈文华，王新红，万雪莲，王德才

(哈尔滨医科大学公共卫生学院，黑龙江哈尔滨 150086)

醇 水交换法提取桦褐孔菌生物活性物质的工艺研究

马微微，陈文华，王新红，万雪莲，王德才*

(哈尔滨医科大学公共卫生学院，黑龙江哈尔滨 150086)

目的:利用超声热学及空化技术，研究醇－水交换提取桦褐孔菌中的三萜类和多糖生物活性物质的最佳提取工艺。方法:桦褐孔菌粉碎，过30目筛，超声辅助醇－水交换提取其生物活性物质。结果:醇提三萜类物质最佳工艺为:温度30℃，时间50min，提取3次，液料比25∶1，得率为1.30%;水提多糖最佳工艺为:温度50℃，时间40min，提取3次，液料比35∶1，得率为6.96%。结论:超声辅助醇－水交换提取桦褐孔菌中的生物活性物质的最佳提取工艺稳定、合理可行，能有效提高桦褐孔菌的综合利用。

桦褐孔菌，醇－水交换，超声

桦褐孔菌是一种生长在寒带的木腐菌，主要寄生于白桦树、银桦、赤杨等的树干或树皮下。在我国主要生长在吉林、黑龙江、西藏、青海等高海拔山区的桦属树木上［1］。随着对桦褐孔菌化学成分研究的不断深入，大量的活性物质被分离出来，目前已报道的除在水提取物中提取出的多糖外还含有醇提取物三萜类、桦褐孔菌醇和栓菌酸等200多种化学成分。作为桦褐孔菌的主要活性成分，三萜类物质和多糖可用于抗肿瘤、抗艾滋病毒、治疗糖尿病［2］、抗衰老［3］、降血压、调节血脂［4］等。目前对桦褐孔菌三萜类物质和多糖的综合提取工艺尚很少报道，本文利用超声热学空化技术，研究醇、水交换提取桦褐孔菌中的两种生物活性物质三萜类及多糖物质的最佳提取工艺，充分利用桦褐孔菌资源，为促进桦褐孔菌的开发和综合利用提供客观的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桦褐孔菌粉 产自伊春市五营区，40℃条件下烘干、粉碎、过30目筛;无水乙醇 天津市凯通化学试剂有限公司，分析纯。

KQ－100DB超声波谱仪 昆山市超声仪器有限公司;FW80粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司; RE－52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;TD4A离心机 长沙英泰仪器有限公司;HPD－25A真空负压过滤器 上海昨非实验室设备有限公司; DZF－6030B真空干燥箱、HWS24电热恒温水浴锅

上海一恒科技有限公司;30目土样分析筛 南京土壤仪器厂;UV－VIS8500紫外－可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取工艺流程

1.2.2 操作要点 桦褐孔菌清选去杂，40℃条件下烘干、粉碎、过30目筛，取10.0g桦褐孔菌粉样品，置于乙醇真空回流提取浓缩罐中，以液料比25∶1，30℃提取三次(50min/次)，收集醇提液，过滤，真空减压浓缩，乙醇回收，浓缩液真空干燥，得三萜类物质;残渣按液料比35∶1的比例加入蒸馏水，50℃提取三次(40min/次)，合并提取液，过滤，真空减压浓缩，浓缩液醇沉12h，离心收集沉淀真空干燥，得多糖。

1.2.3 桦褐孔菌三萜类物质、多糖含量的测定 三萜类物质:香草醛比色法［5－6］;多糖:苯酚—硫酸法［7］。

1.2.5 单因素实验 本研究采用醇－水交换法提取桦褐孔菌中的生物活性物质。按1.2.1的提取工艺，以得率为指标，主要考察提取方法、温度、时间、提取次数和液料比对三萜类物质和多糖得率的影响。

1.2.5.1 提取方法对得率的影响 三萜类物质的提取:温度为40℃，液料比20∶1，溶剂为无水乙醇，超声波功率为100W，采用溶液浸提法与超声辅助提取法，分别提取20、40、60min，提取三次。

多糖的提取:温度为50℃，液料比20∶1，溶剂为蒸馏水，超声波功率为100W，采用溶液浸提法与超声辅助提取法，分别提取30、40、50min，提取三次。

1.2.5.2 提取温度对得率的影响 三萜类物质的提取:固定提取时间为40min，液料比20∶1，超声波功率为100W，分别在温度为20、30、40、50℃中提取，测得率。

多糖的提取:固定提取时间为40min，液料比20∶1，超声波功率为100W，分别在温度为40、50、60、70、80℃中提取，测得率。

1.2.5.3 提取时间对得率的影响 三萜类物质的提取:固定提取温度为40℃，液料比20∶1，超声波功率为100W，分别在时间为20、30、50、60min时提取，测得率。

多糖的提取:固定提取温度为 50℃，液料比20∶1，超声波功率为100W，分别在时间为30、40、50、60min时提取，测得率。

1.2.5.4 提取次数对得率的影响 三萜类物质的提取:固定提取温度为40℃，液料比20∶1，超声波功率为100W，提取时间为40min，分别提取四次，测得率。

多糖的提取:固定提取温度为 50℃，液料比40∶1，超声波功率为100W，提取时间为40min，分别提取四次，测得率。

1.2.5.5 液料比对得率的影响 三萜类物质的提取:固定提取温度为40℃，提取时间为40min，超声波功率为100W，液料比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，测得率。

多糖的提取:固定提取温度为50℃，提取时间为50min，超声波功率为100W，液料比分别为20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，测得率。

1.2.6 正交实验设计 在对提取温度、提取时间、提取次数、液料比四种单因素考察的基础上，选用正交表L9(34)进行正交实验设计。实验因素与水平设计见表1、表2。

表1 醇提因素与水平L9(34)Table 1 Factors and levels on alcohol extraction conditions

表2 水提因素与水平L9(34)Table 2 Factors and levels on water extraction conditions

1.2.7 醇析浓度对多糖得率的影响 取等体积的水提液5份，每份100mL，分别加入100、200、300、400、500mL的无水乙醇，静置12h后，离心收集沉淀，烘干称重，并记录。

1.2.8 醇沉温度对多糖得率的影响 乙醇沉淀法提取多糖时，醇沉的温度是影响多糖得率的重要因素，本实验采用不同温度(4、25℃)来沉淀多糖，测多糖得率。

2 结果与讨论

2.1 三萜类物质含量测定

以吸收度(y)对齐墩果酸含量(x)进行回归，得标准曲线方程为y=0.0027x，r2=0.998。

2.2 多糖含量测定

以吸收度(y)对葡萄糖含量(x)进行回归，得葡萄糖标准曲线方程为y=9.3596x－0.0143，r2=0.995。

2.3 单因素实验

2.3.1 提取方法对得率的影响 超声波提取技术［8］是利用超声波特殊的强纵向振动，高速冲击破碎，产生空化效应，以达到搅拌及加热等物理性能。破坏提取物细胞结构，使溶媒能渗入细胞内部，从而加速有效成分的溶解，提高有效成分的提出率，实验对比分析证明超声波提取可大大缩短提取时间，提高提取率，并且不改变有效成分的结构［9］。由图1可见，在提取三萜类物质和多糖中，在同一时间点采用超声波辅助法的提取率均高于传统水浴法，具有省时、高效、节能、易操作等优点;温度高时会有部分提取物分解，而超声波提取能在低温条件下保证提取物的得率。因此，超声辅助法优于传统水浴提取。

图1 提取方法对得率的影响Fig.1 Effect of methods on extraction yield

2.3.2 温度对得率的影响 由图2可见，超声波辅助方法提取温度低时溶出物少，有效成分含量低;随着温度增加，细胞膜破碎程度增强，溶出物增多，同时温度增加可以加快溶剂的运动速度，减少溶质在固体表面的吸附作用，使细胞中活性物质迅速进入到溶剂中，得率也就增高。但值得注意的是:温度过高对溶解物破坏的可能性大。三萜类物质在40℃时得率最高，达到1.30%;多糖在50℃时得率最高，达到6.87%。

图2 温度对得率的影响Fig.2 Effect of temperature on extraction yield

2.3.3 时间对得率的影响 提取时间决定着生产的周期，是生产工艺研究中的一个十分重要的影响因素，它决定着生产成本和能源的消耗。由图3可见，在一定时间范围内，得率随时间的增加而增加。这是由于超声时间较短时，溶出物较少，提取物含量较低;随着时间增加，细胞膜破碎程度增强，溶出物增多，得率随之增高。三萜类物质、多糖分别在50、40min时得率最高，分别为1.3%、6.87%。当时间过长有效成分已经完全溶出，细胞壁进一步破碎，溶解杂质相应增加，得率反而降低，违背了缩短工时，减少能耗的原则。

2.3.4 提取次数对得率的影响 由图4可知:得率是随着提取次数的增加而增加的。在提取三萜类物质和多糖实验中，提取三次均比提取两次更为明显的增加，而提取四次较三次而言略微改变。考虑到费时因素，避免浪费能源，增加浓缩工序的难度，选择提取三次作为最佳提取次数。

图3 时间对得率的影响Fig.3 Effect of time on extraction yield

图4 次数对得率的影响Fig.4 Effect of times on extraction yield

2.3.5 液料比对得率的影响 由图5可见，当乙醇提取三萜类物质，液料比在10∶1～20∶1时，三萜类物质得率随着液料比的增加而增加，随后得率随之下降，

在液料比为20∶1时得率最高，为1.32%。可知，溶剂量过小，提取物质不能完全溶出;溶剂量过大时，超声波辐射又被溶剂大量吸收，从而影响得率。当水提取多糖，液料比在20∶1～30∶1时，多糖得率随着液料比的增加而增加，在液料比30∶1～35∶1时得率之间无显著差异，随后得率随之下降。由于浸提液的后续工序中需浓缩，若水量增加，工序也随之增加，因此水提多糖液料比选为30∶1。

图5 液料比对得率的影响Fig.5 Effect of ratio of solvent to material on extraction yield

2.3.6 醇析浓度对多糖得率的影响 乙醇沉淀法提取多糖时，乙醇的浓度对多糖得率影响很大。一般情况下，多糖的分子量越大，被沉淀下来所需的乙醇浓度就越小。由图6可见，当乙醇用量为水提取液3倍时，得率最高，当乙醇用量大于水提取液3倍时，多糖得率随之下降，这是由于随乙醇浓度升高，一些多糖中醇溶蛋白分子溶于乙醇中，有些多糖分子与醇溶蛋白相结合，使多糖也溶于乙醇溶液中，不被沉淀下来，造成多糖得率的降低。

图6 醇析浓度对多糖得率的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration on extraction yield of polysaccharides

2.3.7 醇沉温度对多糖得率的影响 醇沉法就是利用有效成分能溶于乙醇而杂质不溶于乙醇的特性，在加入乙醇后，有效成分转溶于乙醇中而杂质则被沉淀出来［10］。醇沉温度低，沉淀物析出与沉降的速度加快，所需的静置时间短，反之则长。由实验结果得知，在4、25℃条件下，多糖得率分别为6.86%和6.25%。由此可见，4℃醇沉效果明显好于25℃，这是由多糖在不同的温度下溶解度不同造成的。

2.2 正交实验

根据表3三萜类物质正交实验结果直观分析得知，影响因素显著性顺序为:D＞C＞B＞A，得率最高组合为A1B3C3D3，即以温度30℃，时间50min，提取3次，液料比25∶1。为了对三萜类物质正交实验的最优化条件进行验证，采用此组合，做了3次平行验证实验，所测得三萜类物质分别为1.28%，1.30%，1.32%，平均值为1.30%，验证实验的数值与优化的结果相吻合，说明正交实验的结果是可行的。

表3 桦褐孔菌三萜类物质提取条件的L9(34)正交实验结果Table 3 Results of orthogonal test on triterpenoids extraction conditions

根据表4多糖正交实验结果直观分析得知，影响因素显著性顺序为:D＞C＞B＞A，正交实验最优组合为 A2B2C3D3，即以提取温度50℃，提取时间40min，提取3次，液料比35∶1。但表4中没有此项组合，故按此组合重新进行实验，通过3次平行实验，测得多糖分别为6.99%、6.95%、6.93%，平均值为6.96%，高于表4出现最高值，故采用此组合为最优组合。

表4 桦褐孔菌多糖提取条件的L9(34)正交实验结果Table 4 Results of orthogonal test on polysaccharides extraction conditions

3 结论

本研究利用超声热学及空化技术，研究醇－水交换提取森林药食两用多孔真菌—桦褐孔菌中的生物活性物质的最佳提取工艺及技术。采用单因素实验和正交实验对超声波辅助提取桦褐孔菌中的生物活性物质的最佳工艺条件进行优选。得出三萜类物质最佳提取工艺为:温度30℃，时间50min，提取3次，液料比25∶1，得率为1.30%;多糖最佳提取工艺为:温度50℃，时间40min，提取3次，液料比35∶1，得率为6.96%。

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Study on the method for ethanol－water exchanging extraction of biological activity content fromInonotus obliquus

MA Wei－wei，CHEN Wen－hua，WANG Xin－hong，WAN Xue－lian，WANG De－cai*(College of Public Health，Harbin Medical University，Harbin 150086，China)

Objective:To studya method forethanol－waterexchanging extraction oftriterpenoidsand polysaccharides fromInonotus obliquusby ultrasound thermal and cavitation technology.Methods:ShatteredInonotus obliquus，filtered them by 30 mesh filter sieve，extracted biological activity content by ethanol－water exchanging and ultrasonic technology.Results:The ethanol optimum extraction of triterpenoids was as follow: extraction temperature 30℃，time 50min，extraction times 3，the rate of liquid and solid 25∶1，and the best extraction was 1.30%.The water optimum extraction of polysaccharides was as follow:extraction temperature 50℃，time 40min，extraction times 3，the rate of liquid and solid 35∶1，and the best extraction was 6.96%.Conclusion:The optimum extraction which ethanol－water exchanging extraction of biological activity content fromInonotus obliquusby ultrasonic technology was steady，reasonable and improve comprehensive utilization ofInonotus obliquuseffectively.

Inonotus obliquus;ethanol－water exchanging;ultrasound

TS201.2

B

1002－0306(2012)21－0273－04

2012－04－13 *通讯联系人

马微微(1985－)，女，硕士研究生，研究方向:植物化学生物活性物质的提取、鉴定、保健功能。