谯顺彬，董汝晶，田 辉，张义明，3，罗 芳，陶希芹

(1.贵州工业职业技术学院，贵州贵阳 550008;

2.贵州茅台酒厂(集团)习酒有限责任公司，贵州习水 564622;

3.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳 550003)

生长因子对螺旋藻混合营养生长及藻胆蛋白含量影响的研究

谯顺彬1，董汝晶1，田 辉2，张义明1，3，罗 芳1，陶希芹1

(1.贵州工业职业技术学院，贵州贵阳 550008;

2.贵州茅台酒厂(集团)习酒有限责任公司，贵州习水 564622;

3.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳 550003)

本文考察了维生素B12(VB12)、精氨酸(Arg)和萘乙酸(NAA)三个生长因子对螺旋藻混合营养培养的影响，并对藻体干重(DW)及藻胆蛋白(PCP)的含量进行检测。实验结果表明:VB12对螺旋藻生长以及藻胆蛋白的积累均有较大影响，NAA对螺旋藻生长影响较大，而Arg对螺旋藻中藻胆蛋白含量影响较大;在单因素实验的基础上，利用响应面法(RSM)确定三个生长因子的最佳水平:VB12、Arg和NAA水平配比为0.08、45、0.3mg/L，此时藻体干重与藻胆蛋白含量分别增加了20.2%和31.9%;以VB12、Arg和NAA为自变量，建立了藻体干重和藻胆蛋白为响应值的二次多项式数学模型。

螺旋藻，混合营养培养，生长因子，藻胆蛋白

螺旋藻(Spirulina)是一种具有光合作用能力的原核微生物，因其细胞呈丝状、缠绕成螺旋状而得名，又称为蓝细菌。螺旋藻属于蓝藻门、蓝藻纲、段殖体目、颤藻科、螺旋藻属［1］，目前发现有50多个种，其中以钝顶螺旋藻(S.platensis)和极大螺旋藻(S.maixma)研究应用最为普遍［2］。螺旋藻营养价值高，含有丰富的蛋白质、碳水化合物、维生素、叶绿素、藻多糖、不饱和脂肪酸及微量元素等物质，其中蛋白质含量约60%～70%，含有8种必需氨基酸且各氨基酸含量均衡，易于人体消化和吸收［3］。藻胆蛋白是存在于红藻和蓝藻中的光合色素，在螺旋藻中主要是藻红蛋白和藻蓝蛋白。其中，藻蓝蛋白占细胞干重10%左右，这是螺旋藻细胞呈蓝绿色或深绿色的原因，而藻红蛋白的含量很少。螺旋藻藻蓝蛋白安全无毒，着色力强，是一种理想的天然的食品着色剂。同时，螺旋藻中的藻多糖具有增强人体免疫力、防癌、防辐射损伤、抗突变、抑制癌细胞DNA的合成和抗衰老等作用［4－7］。因此，螺旋藻已逐步应用于食品、医疗、保健等行业［8］。目前，螺旋藻规模化生产都是采用室外大池培养，由于采用光合自养培养模式对地域和环境条件的依赖性强，培养产率低，这极大地制约了螺旋藻产业的发展。为了满足市场需求，提高产率，增加产量，各国研究人员一直在探索螺旋藻的培养方式。目前，螺旋藻混合营养培养是解决这一发展瓶颈的主要研究方向。混合营养培养主要是通过添加合适的营养成分来降低藻体生长对环境的依赖，促进藻体生长，实现高产［9］。如在螺旋藻培养过程中补加有机碳源葡萄糖已获得了较好的研究结果。但是在螺旋藻培养过程中添加生长因子的研究报道还不多。因此，本研究在进行混合营养培养的基础上，考察生长因子对藻体细胞生长的影响，旨在为提高螺旋藻品质以及产量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

钝顶螺旋藻(S.platensis)fachb－350 中科院武汉水生生物研究所;采用传统的Zarrouk培养基［10］作为基础培养基，AB medium培养基作为对比实验进行培养，试剂均为分析纯，蒸馏水配制后直接装罐。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 在本实验中，分别采用光合自养和混合营养条件进行螺旋藻培养研究。在光合自养条件下，主要是对Zarrouk和AB medium两种培养基进行对比实验，旨在筛选出适合钝顶螺旋藻fachb－350生长的培养基。进行对比实验时，在250mL三角瓶中加入150mL新鲜培养基，接种量为10%，温度30.0℃，初始pH9.5±0.1，连续光照，光照强度4000lx左右，摇床培养，转速 120r/min，培养时间 7d。Zarrouk培养基、AB medium分别记为A1、A2。采用混合营养培养时，根据Zarrouk和AB medium两种培养基对比实验的结果，选择更适合藻体细胞生长的培养基进行混合营养培养实验。根据前期实验结果，在所选的培养基中按1.5g/L的量添加葡萄糖时能获得最大的藻体干重，因此，在本实验过程中，保持光合自养培养条件不变的情况下，葡萄糖添加量为1.5g/L，培养时间延长至10d进行混合营养培养研究。

1.2.2 单因素实验 在混合营养培养条件下，根据螺旋藻的生长特性，实验选取VB12、Arg、NAA三种生长因子进行螺旋藻培养实验，考察对藻体细胞生长及藻蓝蛋白含量的影响，实验先进行单因素实验，即在未添加另外两种生长因子的条件下，研究另外一种因子对藻体细胞生长及藻蓝蛋白含量的影响。

1.2.2.1 VB12对钝顶螺旋藻生长的影响 本实验主要是在混合营养培养条件下研究VB12对藻体细胞生长的影响，VB12的添加浓度为 0.01、0.05、0.1、0.15、0.2mg/L，同时进行对照实验。

1.2.2.2 Arg对钝顶螺旋藻生长的影响 本实验主要是在混合营养培养条件下研究Arg对藻体细胞生长的影响，Arg的添加浓度为10、25、50、75mg/L，同时进行对照实验。

1.2.2.3 NAA对钝顶螺旋藻生长的影响 本实验主要是在混合营养培养条件下研究NAA对藻体细胞生长的影响，NAA的添加浓度为0.1、0.2、0.4、0.6mg/L，同时进行对照实验。

1.2.3 响应面法优化实验 在混合营养培养条件下，根据单因素实验的结果，以藻体干重及藻胆蛋白含量为实验指标，考察VB12、Arg和NAA对藻体细胞生长及藻胆蛋白合成的综合影响。采用响应面法中的中心组合旋转设计对VB12、NAA和Arg的最佳水平及其变化范围进行研究，实验由Design Expert软件设计，选取5个中心点重复，共17组，各因子实验水平编码分别－1、0、1，见表1。

表1 响应面分析法的因素与水平表Table 1 Response surface analysis of factors and level table

1.2.4 藻体生物量测定方法采用干重法［9］(DW)培养结束后，用吸量管取发酵液20mL，放于已烘干至恒重的滤纸进行抽滤，蒸馏水冲洗两次，85℃烘干至恒重，用精密电子天平称量。

1.2.5 藻胆蛋白测定方法 采用紫外分光光度法［11］。

1.2.6 光照强度的测定 用照度计LUX－101直接测定，单位:klx。

2 结果与分析

2.1 两种培养基的结果比较

按照摇瓶培养方法，采用Zarrouk、AB培养基进行光合自养，结果如表2所示。A1、A2培养基的藻体干重分别为0.5550、0.7128g/L，A2比A1增加约28%，表明经改良的A2培养基比A1培养基对钝顶螺旋藻的生长有利。培养结束后对培养液的pH进行测定发现A2培养液中的pH略低于A1，主要原因是A2培养基中的碳源为NaHCO3和Na2CO3，这两种成分能形成较好的缓冲溶液体系。因此，采用A2培养基培养螺旋藻能减少由于pH的过快上升引起对螺旋藻生长的影响。所以在接下来的研究过程中采用A2培养基为基础培养基进一步研究螺旋藻混合营养培养的方法。

表2 不同培养基光合自养培养下的钝顶螺旋藻生长情况Table 2 Different medium photosynthetic cultured of Spirulina growth

2.2 VB12对钝顶螺旋藻生长的影响

在混合营养条件下，VB12对藻体细胞的生长及藻胆蛋白的含量影响见图1。由图可知，与对照实验相比，添加VB12可以提高藻体干重以及增加藻胆蛋白的含量。当VB12添加浓度为0.01～0.1mg/L时，藻体干重及藻胆蛋白含量均呈上升趋势，当 VB12浓度为0.1mg/L时，藻体干重达到最大值1.5171g/L，而VB12添加浓度为0.01～0.1mg/L时，藻胆蛋白含量有明显增加。根据四吡咯生物合成途径分析［1］，可能的原因是VB12作为螺旋藻中藻胆色素以及叶绿素等生成的前体物质之一，可以促进螺旋藻生长过程中光能的转化，达到为螺旋藻生长提供充足的能源。

2.3 Arg对钝顶螺旋藻生长的影响

图2表示添加不同浓度的Arg对藻体生长及藻胆蛋白含量的影响。在混合营养条件下，与对照实验相比，添加一定浓度的Arg可以提高藻体干重以及增加藻胆蛋白的含量，但从增加趋势来看，添加Arg对藻胆蛋白含量的影响更大，这很可能是在藻体细胞的生长过程中，Arg作为一种激素或激素前体的形式进入细胞，通过提高细胞中的色素质量比及酶的水平而促进细胞的生长，从而能积累更多藻胆蛋白。同时，Arg还可以作为螺旋藻生长的备用氮源，保护合成的藻胆蛋白不会因氮源的缺少而被降解利用。

图1 不同浓度的VB12对螺旋藻生长的影响Fig.1 Effect of different concentrations of VB12 on the growth of Spirulina

图2 不同浓度Arg对螺旋藻生长的影响Fig.2 Effect of different concentrations of Arg on the growth of Spirulina

2.4 NAA对钝顶螺旋藻生长的影响

图3表示添加不同浓度的NAA对藻体细胞生长及藻胆蛋白含量影响。在混合营养条件下，与对照实验相比，添加一定浓度的NAA可以提高藻体干重，而藻胆蛋白的含量变化基本不明显。当NAA添加浓度为0.1～0.4mg/L时，藻体干重及藻胆蛋白含量均呈上升趋势，当NAA浓度为0.4mg/L时，藻体干重达到最大。其原因是NAA作为一种植物生长促进剂，作用于细胞时能与细胞受体结合，从而促进质子分泌到细胞壁，致使细胞延伸快，还能促进RNA和蛋白质的生物合成，为原生质和光合膜的合成提供原料。然而，当NAA浓度超过0.4mg/L时，藻体干重随着NAA增加而降低。同时，从图可知，在整个实验过程中，添加NAA对藻胆蛋白含量的影响都不明显。

图3 不同浓度NAA对螺旋藻生长的影响Fig.3 Effect of different concentrations of NAA on the growth of Spirulina

2.5 生长因子对藻体干重及藻胆蛋白含量的影响

生长因子VB12、NAA和Arg对钝顶螺旋藻生长的实验结果见表3。

利用Design Expert 7.0对表3藻体干重DW数据进行多元回归拟合，获得以DW为响应值，VB12、Arg和NAA为自变量的二次多项式回归方程:

DW=1.66－0.067A－0.04B－0.011C+8.250E－003AB－8.500E－003AC－1.750E－003BC－0.066A2－0.042B2－7.909E－003C2式(1)

对式(1)进行方差分析，结果见表4。其中，F= 26.49＞F0.01(9，10)=4.94，p＜0.0001，说明该模型的概率在α=0.01水平上差异显著;模型复相关系数R2=0.9640，说明藻胆蛋白的实验值与预测值之间具有很好的拟合度;其校正决定系数=0.9178，表明有约8%的藻体干重总量变异不能由该模型进行解释。

对方程(1)求导，当VB12、Arg和NAA三个因子分别达到最佳水平0.092、61、0.394mg/L时，藻体干重最大预测值为1.6192g/L。

表3 响应面分析实验方案与实验结果Table 3 Response surface analysis experiment scheme and experimental results

由表4可知，三个因子对藻体生长的影响大小依次为NAA＞VB12＞Arg，前两个因子极其显著(p＜0.01)，而Arg影响不大。

其次，从三个因子的交互作用来看，只有VB12和NAA对藻体生长影响较显著(p＜0.05)，见图4。其余两两交互均不显著。

同时，利用Design Expert 7.0对表3藻胆蛋白含量PCP数据进行多元回归拟合，获得以PCP为响应值，VB12、Arg和NAA为自变量的二次多项式回归方程:

对式(2)模型系数和概率进行方差分析，F=38.01＞F0.01(9，10)=4.94，p＜0.0001，说明该模型的概率在α=0.01水平上差异显著;模型复相关系数 R2=0.9716，说明藻胆蛋白的实验值与预测值之间具有很好的拟合度;其校正决定系数=0.9640，表明有约3.36%的藻胆蛋白总量变异不能由该模型进行解释。

表4 DW回归方程系数及其显著性检验Table 4 Regression coefficient and their significance of the DW model

图4 VB12和NAA对螺旋藻DW交互影响的曲面图Fig.4 Response surface plot of DW versus VB12and NAA

对方程(2)求导，当VB12、Arg和NAA三个因子分别达到最佳水平0.0662、25.6、0.2165mg/L时，藻胆蛋白最大预测值为168.1mg/g。

由表5可知，三个因子对藻体生长的影响大小依次为NAA＞VB12＞Arg，其中只有NAA对藻胆蛋白含量的积累影响显著(p＜0.05)，而VB12和Arg影响均不明显。

表5 螺旋藻藻胆蛋白含量回归方程系数及其显著性检验Table 5 Regression coefficient and their significance of the PCP model

从三个因子的交互作用来看，只有VB12和Arg对藻体生长影响较显著(p＜0.05)，见图5。其余两两交互均不显著。

图5 VB12和Arg对PCP交互影响的曲面图Fig.5 Response surface plot of PCP versus VB12and Arg

2.6 优化实验

本研究不仅仅是为了获得最大的藻体干重，同时也要积累更多的藻胆蛋白，以期获得较高品质的螺旋藻产品。因此，根据上述响应面研究结果，在混合营养培养条件下，对VB12、Arg和NAA的最佳水平作进一步优化。实验共5组，水平配比与结果如表6所示。结果表明，当VB12、Arg和NAA水平为0.08、45、0.3mg/L时，与未添加生长因子时相比，藻体干重与藻胆蛋白含量分别增加了20.2%和31.9%。实验结果表明，三个生长因子不仅能提高细胞的生长速率，而且能促进细胞中积累更多的藻胆蛋白。

表6 优化实验Table 6 Model validation experiments

3 结论

在本实验中，分别进行了光合自养和混合营养培养实验。首先在光合自养条件下，采用Zarrouk和AB两种培养基进行螺旋藻培养对比实验时，结果表明，在相同培养条件下，AB培养基比Zarrouk培养基更有利于螺旋藻生长，藻体干重提高了近28%，故选择AB培养基进行混合营养实验。其次，在混合营养培养条件下，选取了VB12、Arg和NAA进行研究，考察这三个因子对细胞生长及藻胆蛋白合成的影响。结果表明，当VB12、Arg和NAA添加浓度分别为0.08、45、0.3 mg/L时，与对照实验相比，藻体干重与藻胆蛋白含量分别增加了20.2%和31.9%;表明这三种生长因子不仅能提高细胞的生长速率，而且能促进细胞中积累更多的藻胆蛋白，但是具体的机理以及在大规模的培养时的效果有待进一步验证。

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The influence of positive growth factor on mixotrophic growth ofS.platensisand the content of phycobiliproteins

QIAO Shun－bin1，DONG Ru－jing1，TIAN Hui2，ZHANG Yi－ming1，3，LUO Fang1，TAO Xi－qin1
(1.Guizhou Industry Polytechnic College，Guiyang 550008，China;
2.Guizhou MouTai(Grounp)Xi Jiu Company Limited，Xishui 564622，China; 3.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，Guiyang 550003，China)

In this paper，three critical growth factors were selected to research the influence for the growth of Spirulina platensis，employing the response surface methodology to optimize the culture conditions of biomass concentration and phycobiliprotein accumulation.Three critical factors selected for investigation were VB12，Arg and NAA.Firstly，single－factor experiment was used to determine the range which the biomass concentration of Spirulina platensishad the obvious improvement.Secondly，the response surface methodology was used to optimize the three factors，and to build up a quadratic regression equation with dry weight and PCP as the response，VB12，Arg and NAA as independent，respectively.Finally，after optimization of the experiment showed that，the best level was VB12，Arg and NAA 0.08，45，0.3mg/L，dry weight and phycobiliprotein content，an increase of 20.2%and 31.9%，respectively.

Spirulina platensis;mixtrophic growth;positive growth factor;phycobiliproteins

Q939.97

B

1002－0306(2012)21－0254－05

2012－05－24

谯顺彬(1981－)，男，硕士研究生，研究方向:光生物反应器的研究设计。

国家自然科学基金项目(39860004);贵州省科学技术基金项目(黔科合J字［2010］2068号)。