姚 曦，岳永德，汤 锋

(国际竹藤中心，北京 100102)

响应面法优化竹叶黄酮萃取工艺及其抗氧化研究

姚 曦，岳永德，汤 锋

(国际竹藤中心，北京 100102)

利用微波提取慈竹叶中总黄酮类化合物。在单因素实验的基础上，采用响应面法研究微波提取的最佳工艺条件。结果表明，以80%的乙醇为提取溶剂，微波提取最佳条件为:提取温度70℃、提取时间10.5min、液固比为34∶1mL/g;在此工艺条件下，慈竹叶总黄酮得率为1.381%。抗氧化活性研究表明，慈竹竹叶总黄酮DPPH·清除作用较好，其IC50值为141.5mg/L，优于相同浓度的2，6－二叔丁基对甲酚(BHT)。

竹叶，总黄酮，微波辅助提取，响应面法，抗氧化活性

竹子属于单子叶植物(Monocotyledoneae)中的禾本目 (Graminales)禾本 科 (Poaceae)竹 亚科(Bambusoideae)，在我国有着悠久的药用历史。《本草纲目》记载:“淡竹叶气味辛平，大寒，无毒;主治:心烦、尿赤、小便不利等。苦竹叶气味苦冷、无毒;主治口疮、目痛、失眠、中风等”。近些年来研究［1］表明竹叶中含有黄酮类化合物，因其具有良好的抗氧化、抗癌、抗炎抑菌、降低胆固醇等多种药理活性，其药用价值日益被人们所重视。微波辅助萃取(MAE)是近年来发展较快的新型提取方法，具有高效性、提取时间短、能耗低、节约溶剂等特点，在国内外已被广泛应用于食品、环境、天然活性成分等提取［2－4］。很多文献报道了应用微波萃取植物中的总黄酮成分，如对葛根［5］、山楂叶［6］、满山红叶［7］、党参［8］等的总黄酮的萃取。近年来，不少学者对竹叶中黄酮类物质的提取技术进行了多方面积极和有益的探索，但主要集中在对传统提取方法的优化改良上［9－11］，有关微波辅助提取的文献报道少见。本实验运用响应面分析法(Response Surface Analysis，RSA)，并采用Box－Benhnken Design的中心组合实验设计［12－13］，对提取条件进行优化，对拟合数学模型进行描述，筛选出微波提取竹叶总黄酮的最佳工艺条件，同时对慈竹竹叶总黄酮的抗氧化活性进行评价，旨在为竹资源的综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

慈竹(Neosinocalamus affinins)竹叶 采自四川绵竹，自然阴干后再于60℃烘干至恒重后，于高速粉碎机粉碎，取过60目筛的竹粉于干燥器内备用。

微波消解仪 美国CEM公司MARS－5型;紫外－可见分光光度计 美国PE公司6400型。

1.2 实验方法1.2.1 标准曲线的建立［14］精确称取于120℃干燥至恒重的芦丁对照品0.01g，用80%乙醇溶解，定容于100mL容量瓶中，配制成0.1g/L的芦丁对照品溶液。准确移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的芦丁对照品溶液于10mL容量瓶中，用乙醇补充至5.0mL;加入0.1mol/L氯化铝溶液4mL，最后用30%乙醇补充至刻度，摇匀后放置15min;以相应试剂做空白，于406nm处测定吸光度，制作芦丁标准曲线。

1.2.2 竹叶黄酮的提取及含量测定 准确称取竹叶样品0.60g，置于微波提取罐中，按一定液固比加入溶剂。分别按实验设计的条件进行萃取，仪器设定为控温模式，微波功率为600W［15－17］。反应后冷却至室温取出，过滤，定容到25mL容量瓶中，取待测液1.0mL，置于10mL容量瓶中，用溶剂补充到5.0mL，按照测定芦丁标准溶液吸光度的方法测定其吸光度A。

1.2.3 竹叶黄酮得率计算 根据标准曲线，由吸光度A计算出黄酮质量浓度c，竹叶总黄酮得率Y/(mg·g－1)则由下式计算:

式中:c为黄酮质量浓度，mg/mL;10为10倍;25为mL;m为竹叶质量，g。

1.2.4 响应面法优化实验 在单因素实验的基础上，以提取时间、提取温度、液固比等因素为考察变量，以总黄酮得率Y为响应值，应用Design－Expert 8.05软件，优化微波提取竹叶总黄酮的工艺条件。实验因素与水平设计见表1。

表1 Box－Behnken设计实验因素水平Table 1 Coded levels of variables of the central composite experimental design(CCD)

1.2.5 竹叶黄酮抗氧化实验 将待测抗氧化剂配制成系列溶液，测定各浓度抗氧化剂对DPPH自由基清除率，在清除率20%～80%的范围内，绘制清除率对浓度曲线，计算出清除率为50%时的浓度值，即为IC50值。

2 结果与分析

2.1 线性回归方程

根据各浓度芦丁对应的吸光度，计算得到线性回归:A=32.3c－0.0228，相关系数R=0.9998。

2.2 单因素实验

黄酮类化合物宜溶于乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂中。乙醇无毒，对天然药物细胞有较强的穿透能力，对许多成分溶解性能好且能抑制酶的催化作用，所以本研究采用80%乙醇为提取溶剂。

2.2.1 提取温度对总黄酮得率的影响 在乙醇浓度为80%，液固比为30mL/g，提取时间为10min的条件下，考察不同提取温度对总黄酮得率的影响，结果如图1所示。

图1 提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction ratio

由图1可以看出，随着温度的升高，提取率随之增加，当温度达到70℃后，继续升温，提取率略有下降，这可能和黄酮类化合物热稳定性有关，且过高温度下提取物中的活性成分容易被破坏，杂质溶出量增加，给后续操作带来不便，成本增大。

2.2.2 提取时间对总黄酮得率的影响 在液固比为30mL/g，提取温度为70℃的条件下，考察微波提取时间对总黄酮得率的影响。由图2可以看出，微波提取时间在6～10min范围内，随着提取时间的增加，总黄酮得率逐渐增加;若进一步增加提取时间，总黄酮得率则有所降低。这说明提取时间过短，黄酮类物质还未充分溶出，而时间过长，一些热敏性组分被破坏或部分溶剂挥发导致乙醇浓度降低而使黄酮类化合物提取率降低［18］。

图2 提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction ratio

2.2.3 液固比对竹叶总黄酮得率的影响 在提取温度为70℃，提取时间为10min的条件下，考察液固比对总黄酮得率的影响，结果如图3所示。

图3 液固比对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of liquid－to－solid on extraction ratio

由图3可看出，随着液固比的增加，总黄酮得率呈现出由低到高，并趋于稳定的趋势。一方面溶剂用量的增加可以增大样品与溶剂的接触面，有利于扩散速度的提高;另一方面，当液固比达到一定的比例时，黄酮已经基本提取完全，不再溶出。

表3 黄酮提取参数数学回归分析结果Table 3 Results of regression analysis of extraction factors for Flavoniods extraction

2.3 响应面法对慈竹总黄酮微波提取工艺参数的优化

实验分析方案及结果见表2。

表2 实验方案与结果Table 2 Design and results of tests

将所得实验数据进行多元回归拟合，得到竹叶黄酮得率Y与微波提取各因素变量的二次回归方程模型为:

为了检验方程的有效性，对微波提取慈竹总黄酮的数学模型进行方差分析，并对各因子的偏回归系数进行检验，结果见表3。此模型的决定系数R2为0.9976，线性关系极显著;一次项中X2、X3的回归系数极显著，说明提取时间和液固比对总黄酮得率有极显著影响，与X1相关显著，即提取温度对响应值有显著影响;交互项X1X2和X1X3的偏回归系数极显著，说明提取温度和提取时间、提取温度和液固比的交互项对总黄酮的得率有极显著影响;二次项中X12、X22、X3

2的偏回归系数达到极显著水平。回归方差分析显著性检验结果表明，该模型回归极显著，且失拟项不显著(p=0.058＞0.05)，说明该方程对实验拟合较好。将表2中的实验数据对此方程所代表的面进行分析，可以推测出优化条件在实验中所覆盖的区域，或是指明在哪些方向上再进行实验可得到更好的结果。

根据回归方程做出响应面，考察拟合响应曲面的形状，分析提取温度、提取时间和液固比对黄酮总得率的影响，结果见图4～图5。由图4可以看出，一定范围内，总黄酮得率随提取温度和提取时间的增加而提高，两者交互作用显著。根据动力学理论，时间的延长有利于黄酮的充分扩散析出，同时微波功率的提高使得分子解附和扩散运动速率加快，从而增加了黄酮的析出速率及其得率。因此，适当增加提取温度和提取时间有助于提高总黄酮的得率。

图4 Y=f(x1，x2)响应面立体图Fig.4 Response curved surface figure of Y=f(x1，x2)

由图5可知，在一定范围内，总黄酮得率随提取温度和液固比的增加呈上升趋势。液固比的增加能增大液－固两相黄酮的浓度梯度，从而提高黄酮溶出的速率及其得率。但溶剂量太大会造成溶剂回收耗时较长，能耗高以及资源浪费。

2.4 提取工艺条件的确定及可靠性验证

图5 Y=f(x1，x3)响应面立体图Fig.5 Response curved surface figure of Y=f(x1，x3)

在模型取值范围内选择最低点为出发点，依模型使用快速上升法进行优化，可得微波提取总黄酮的最佳理论工艺条件为:提取温度70.28℃，提取时间10.35min，液固比33.85mL/g，此条件下竹叶总黄酮得率为1.372%。

为检验响应曲面法的可靠性，采用上述优化条件进行实验，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为提取温度70℃，提取时间10.5min，液料比34∶1(mL/g)，实际测得的总黄酮平均得率为1.381%，与预测值基本一致。因此，采用RSA法优化得到的提取条件准确可靠，具有实用价值。

2.5 竹材提取物抗氧化实验效果

最优条件下萃取慈竹黄酮提取物和两种阳性对照溶液的50%清除率的浓度见表4。

表4 慈竹样品抗氧化测定IC50值Table 4 IC50values of sample

由表4可知，慈竹总黄酮提取物表现出较好的抗氧化效果，其IC50值为141.5mg/L，抗氧化效果弱于TBHQ，同时是合成抗氧化剂BHT清除超氧离子能力1.79倍，表现出很较强的抗氧化活性水平。

3 结论

本研究在单因素实验的基础上，采用RSA法优化了微波提取慈竹叶总黄酮的工艺参数，建立了回归模型方程，该模型回归极显著，且失拟项不显著，说明该方程对实验拟合较好。根据优化提取条件进行验证实验，在乙醇浓度为80%，提取温度70℃，提取时间为10.5min，液固比为34∶1(mL/g)的条件下，慈竹叶中的总黄酮提取率为1.381%。采用响应面法优化的总黄酮微波辅助提取工艺条件对竹叶黄酮的综合利用以及黄酮类化合物的产业化具有理论指导意义。萃取得到的竹叶黄酮具有较好的抗氧化能力，可作为一种理想天然抗氧化剂的提取原料，本研究也为竹资源的高附加值利用提供一定的参考依据。

［1］张英.天然功能性竹叶提取物——竹叶黄酮［J］.中国食品添加剂，2002，54(3):58－66.

［2］Hermo M P，Barron D，Barbosa J.Determination of residues of quinolones in pig muscle:Comparative study of classical and microwave extraction techniques［J］.Analytica Chimica Acta，2005，539(1/2):77－82.

［3］Sporting S，Baawadt S，Svensmark B，et al.Comprehensive comparison of classic Soxhlet－extraction with Sox－tec extraction，ultrasonication extraction，supercritical fluid extraction，microwave assisted extraction and accelerated solvent extraction for the determination of polychlorinated biphenyls in soil［J］.Journal of Chromatography，2005，1090(1/2):1－9.

［4］Golmakani M T，Rezaei K.Comparison of microwave－assisted hydrodistillation with the traditional hydrodistillation method in the extraction of essential oils from Thymus vulgaris L［J］.Food Chemistry，2008，109(4):925－930.

［5］陈斌，南庆贤，吕玲.微波萃取葛根总黄酮的工艺研究［J］.农业工程学报，2001，17(6):123－126.

［6］郭永学，李楠，仉燕来.山楂叶总黄酮的微波辅助萃取研究［J］.中草药，2005，36(7):1011－1013.

［7］孟辉，刘国良，邹向宇，等.微波辅助萃取满山红叶中总黄酮的研究［J］.分析科学学报，2005，21(6):673－675.

［8］王庆明，张金生，李丽华，等.微波辅助萃取党参中黄酮的研究［J］.人参研究，2010(1):24－26.

［9］何春雷，罗学平，李丽霞，等.竹叶黄酮提取工艺的研究［J］.四川农业大学学报，2006，26(4):409－412.

［10］郭雪峰，岳永德.竹叶黄酮的提取纯化及含量测定方法比较研究［J］.安徽农业大学学报，2007，34(2):279－282.

［11］张珊珊，赵晓红.不同提取方法对北京市早园竹叶黄酮提取效率比较［J］.食品科技，2008(3):167－170.

［12］Mehran J，Alizadeh M，Pirozifard M，et al.Optimization of enzymatic degumming process for rice bran oil using response surface methodology［J］.LWT－Food Science and Technology，2008，41(10):1892－1898.

［13］Zafer E，Filiz I.Optimization of hot air drying of olive leaves using response surface methodology［J］.JournalofFood Engineering，2009，91(4):533－541.

［14］张敏，曹庸，唐纯翼，等.Al3+－芦丁二元络合物荧光光度法测定银杏叶中总黄酮的含量［J］.分析科学学报，2005，21 (2):118－120.

［15］周一鸣，周小，田呈瑞.利用响应面法确定微波提取苦荞麸皮黄酮的最佳条件［J］.食品科学，2007，28(11):253－257.

［16］刘志祥，韩磊，曾超.响应面法优化微波提取苦丁茶总黄酮的工艺研究［J］.时珍国医国药，2009，20(5):1122－1124.

［17］李盈蕾，陈建华，陈亚洲.槲寄生总黄酮微波提取工艺及其抗氧化活性研究［J］.食品科学，2010，31(12):62－66.

［18］朱万靖，倪培德，江志炜.沙棘果渣中黄酮类化合物最佳提取工艺研究［J］.中国油脂，2001，26(1):35－37.

Study on optimization of extraction of falconoid from bamboo leaves by response surface analysis and its antioxidant activity

YAO Xi，YUE Yong－de，TANG Feng
(International Centre for Bamboo and Rattan，Beijing 100102，China)

The extraction of total flavoniods fromNeosinocalamus affininsleaves by microwave－assisted extraction was carried out，and the optimal extraction conditions was studied，such as extraction temperature，extraction time and liquid－to－solid ratio，by response surface analysis(RSA)based on single factor tests.The results showed that the optimal extraction conditions were as follows in the presence of 80%ethanol as solvent，extraction temperature 70℃，extraction time 10.5minutes and liquid－to－solid ratio 34mL/g.Under the optimal conditions，the yield of total flavoniods fromNeosinocalamus affininsleaves reached 1.381%.Antioxidant activities were evaluated by using 1，1－dipheny－l2－picrylhydrazyl(DPPH)radical in vitro.The IC50was 141.5mg/L，and the result showed that the DPPH radical scavenging activity of flavonoids was stronger that of DPPH.

bamboo leaf;total flavoniods;microwave－assisted extraction(MAE);response surface analysis (RSA);antioxidant

TS201.2

B

1002－0306(2012)21－0223－04

2012－03－15

姚曦(1981－)，男，博士生，助理研究员，研究方向:植物化学、食品分析。

林业公益性行业科研专项(20100400708);国际竹藤中心基本科研业务费项目(1632010009)。