刘长建，刘 秋，姜 波，孙天竹，闫建芳

(大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116600)

产苯乳酸乳酸菌的筛选鉴定

刘长建，刘 秋，姜 波，孙天竹，闫建芳

(大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116600)

利用厌氧培养法，从猪的盲肠、小肠、大肠和粪便中筛选得到24株乳酸菌，液相色谱法测定产苯乳酸，有7株乳酸菌的苯乳酸产量在80～110mg/L之间，有4株的产量超过119mg/L，其中分离自猪粪便的菌株r16的苯乳酸产量最高，达到233.0mg/L。经16S rDNA系统发育分析，结合菌落形态、细胞形态、生化反应实验，最终确定菌株r16和m15为植物乳杆菌，而菌株m343和m462为粪肠球菌。

猪，乳酸菌，苯乳酸，鉴定

抗生素的长期使用导致了耐药病原菌的产生，这些病原菌和抗生素本身会通过肉蛋等食物在人体内富集，因此抗生素的使用正在被逐步取消和严格控制。有机酸在几年内可作为抗生素的替代品，而苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，就是一种新型的有机酸类抑菌物质，与细菌素相比，苯乳酸具有更广的抑菌谱，对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、单核增生性李斯特菌，革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌和真核微生物如曲霉、青霉等均有抑制作用［1］。其抑菌机理与溶菌酶类似，作用位点是细胞壁，而Nisin等细菌素作用于细胞膜［2－3］;也有研究推测苯乳酸因与苯丙氨酸脱氢酶的底物相似而产生抑制，从而改变了蛋白质的表达［4－5］。苯乳酸能改善宿主的生长性能，是由于其抗菌活性减少了微生物与宿主的竞争，从而减少了营养的损耗;另外，也能降低亚临床感染的发生率和免疫介质的分泌，从而改善了蛋白质和能量的消化吸收效率［6］。苯乳酸逐渐作为天然防腐剂被应用于食品工业，也用于医药和化妆品工业［1，7］，以及替代抗生素应用在养殖业［6］。苯乳酸可由多种微生物产生，如白地霉［8］、红球菌［5］、丙酸霉［9］和乳酸菌［10－11］。2000年，Lavermicocca［11］分离到的植物乳杆菌21B能发酵产生苯乳酸，产量为56mg/L。Valerio等［12］发现大多数乳酸菌(涉及12个种29株)都能够产生苯乳酸;但产量较低，苯乳酸的浓度在16.6～99mg/L之间。李兴峰等［13］分离的112株乳酸菌中有70株的苯乳酸产量在16.6～91.4mg/L之间。本研究通过高效液相色谱法快速检测发酵液中苯乳酸含量的方法，从猪消化系统分离出高产苯乳酸的乳酸菌。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

消化系统内容物 采自当地农家300日龄猪的小肠、盲肠、大肠和肛门等部位;苯乳酸(CAS20312－36－1，纯度98%，百灵威)等主要试剂 均为分析纯产品;PCR反应所用的相关试剂 均购于大连宝生物公司;培养基 包括MRS培养基(Merck)、M17培养基(Oxoid)、PY培养基和PYG培养基。

LC－20AB液相色谱仪 日本岛津;CF15RX高速冷冻离心机 日本日立;DNP－9052恒温培养箱上海精宏等。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的初步分离及纯化 无菌操作分别从现宰杀的猪的小肠、盲肠、大肠、肛门取内容物。取1.0g样品加入9.0mL生理盐水，按10倍梯度稀释，取100μL分别涂布于含碳酸钙的2种固体培养基，37℃静置厌氧培养24～48h。挑取产生溶钙圈的单菌落，转接于对应的培养基中，37℃培养24h。筛选过氧化氢酶阴性、革兰氏阳性、HPLC法检测产乳酸的菌株进行下一步研究［14］。

1.2.2 高效液相色谱法的苯乳酸检测 利用反相柱高效液相色谱法［13，15］检测分析发酵液中的苯乳酸。色谱柱:C18(4.6mm×250mm，5μm，UG120，Shiseido);流动相:A为0.05%三氟乙酸甲醇溶液，B为0.05%三氟乙酸水溶液;洗脱程序:0～20min为10%～90% A;检测波长:210nm;室温;流速:1mL/min;进样量:20μL。

苯乳酸标准曲线的绘制:称取0.0100g苯乳酸标准品，溶于0.1%磷酸缓冲液(pH2.5)，定容5mL。然后稀释苯乳酸溶液浓度分别为:0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg/mL。用0.2μm膜过滤各浓度的标准品溶液后用高效液相色谱法测定，以苯乳酸标准液浓度(mg/mL)对峰面积A作标准曲线。得到了苯乳酸标准曲线(图1)，测出的峰面积(y)与苯乳酸的浓度(x)成正比关系，用此种方法测定菌液苯乳酸产量的变化是切实可行的。

图1 苯乳酸的标准曲线Fig.1 Standard curve of phenyllactic acid

1.2.3 HPLC法筛选产苯乳酸的乳酸菌 将菌株以5%的接种量分别接种于含2.0g/L苯丙氨酸的MRS和M17液体培养基，37℃静置培养36h。发酵液离心后取上清，0.2μm的膜过滤。由高效液相色谱测定苯乳酸的含量，筛选出高产苯乳酸的菌株。

1.2.4 乳酸菌的生物学特征 观察菌落形态，革兰氏染色后显微镜下观察菌体形态特征;葡萄糖和葡萄糖酸盐产酸实验、淀粉水解实验、石蕊牛奶实验、明胶液化实验、乙酰甲基甲醇实验(V－P实验)、精氨酸产氨实验、碳水化合物发酵产酸测定。

1.2.5 乳酸菌的分子生物学鉴定 参照文献［16］中的微波法稍加修改，提取基因组DNA。以F27(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')和 R1492(5'－TACGGTTACCTTGTTACGACTT－3')为引物，对其16S rDNA进行扩增。PCR产物委托宝生物公司进行测序。将菌株的测序结果输入NCBI核酸数据库中，利用在线Blast程序与NCBI数据库中的序列进行比对分析，结合 eztaxon网(http://147.47.212.35:8080/ index.jsp)的比对结果。并利用MEGA5.0的基于距离的邻接法(Neighbor－Joining)，采用Kimura－2参数(Kimura 2－parameter)模型进行系统发育树的构建。

2 结果与分析

2.1 产苯乳酸乳酸菌的筛选

从猪源消化系统中分离到产生溶钙圈的疑似菌株146株，其中24株的接触酶反应为阴性，经革兰氏染色，在显微镜下观察皆为阳性菌。

24株乳酸菌在添加了苯丙氨酸的培养基中，37℃静置培养36h后，将样品的发酵液滤液进行检测，结果发现样品在保留时间13.896～13.987min时有明显的峰，与标准样品出峰时间(13.937min)一致，液相色谱图见图2。结果表明24株乳酸菌均能转化苯丙氨酸产生苯乳酸，其中有11个菌株能够至少产80mg/mL苯乳酸。从中筛选4株高产苯乳酸的乳酸菌m15、r16、m343、m462，其中乳酸菌m15和r16是从猪的粪便中分离的，而乳酸菌m343分离自盲肠，菌株m462来自小肠(表1)。乳酸菌r16苯乳酸的产量远远高于其它菌株，达到233.0mg/L;而乳酸菌m15、m343和 m462的苯乳酸产量分别为 131.4、119.4、123.0mg/L。

表1 高产苯乳酸乳酸菌的筛选和其鉴定的结果Table 1 Phenyllactic acid－producing lactic acid bacteria and 16S rDNA identification

2.2 菌落形态、细胞形态和生理生化特性

筛选出的4株乳酸菌革兰氏染色均为阳性，无芽孢，菌落的边缘和表面都是整齐的。m15和r16的细胞多数是短杆状，菌落为乳白色，比另外m343和m462的菌落要稍微扁平一些;而m343和m462多数为球形，其菌落为灰白色。

生化特性实验结果见表2。4株乳酸菌均不能水解淀粉，石蕊牛奶均产酸，不能使明胶液化，且V－P实验结果也均为阴性，精氨酸均产氨，均能水解七叶苷。

表2 生化特性实验结果Table 2 Physiological characteristics of stains

2.3 16S rDNA鉴定

用微波提取乳酸菌基因组DNA，扩增产物在100V电压下进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后在紫外灯下可见到清晰的条带，PCR产物的分子量约为1500bp(图3)。

图2 样品发酵液的HPLC图谱Fig.2 Chromatograms of strains culture medium supernatant

将测出的菌株 m15、r16、m343、m462的 16S rDNA序列提交到GenBank上，获得登录号分别是JQ340028、JN859533、JQ340029、JQ340033(见表1)。与NCBI进行BLAST比对，结果发现菌株m15和r16的16S rDNA序列与多株Lactobacillus plantarum的16S rDNA序列同源性最高。经过MEGA软件的遗传距离分析，与L.plantarumJCM 1149的同源性都达到99.8%。用MEGA5.0构建系统发育树(图4)，显示与L.plantarumJCM 1149聚在同一个分支。结合菌株的形态特征、生理生化特征，因此可将乳酸菌m15和r16鉴定为L.plantarum。

而m343、m462菌株的16S rDNA序列与多株Enterococcus faecalis的16S rDNA序列同源性最高，与eztaxon网上比对结果一致。经过MEGA软件的遗传距离分析，与E.faecalisJCM 5803的同源性都达到99.9%。从GenBank中调取的亲缘关系相近的16S rDNA全序列进行聚类分析(图4)，菌株 m343和 m462与E.faecalisJCM 5803在同一分支上。结合菌株的形态特征、生理生化特征，可以确定菌株m343和m462都属于肠球菌属(Enterococcus)中的粪肠球菌(E.faecalis)。图4中分枝上的数值为自举(No.of Bootstrap Replicaion)1000次的结果。

图3 乳酸菌的16S rDNA纯化后的电泳图谱Fig.3 Electrophoresis pattern of purified 16S rDNA of strains

图4 菌株m15、r16、m343、m462和参比菌株的16S rDNA基因同源性的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based 16S rDNA sequences similarity of strain m15，r16，m343，m462 and the reference strains

3 结论

乳酸菌在自然界中分布广泛，可栖居于人和动物的消化道及其它器官内，这些特点有利于将来更好地开发利用乳酸菌。本实验从猪的消化系统分离纯化出接触酶反应为阴性、革兰氏染色为阳性、能产乳酸的24株乳酸菌。采取在培养基中添加苯丙氨酸的方法，37℃静置培养36h，利用HPLC法测定乳酸菌发酵液中苯乳酸的产量，筛选出4株高产苯乳酸的菌株，苯乳酸产量均大于119mg/L，其中粪便中筛选出的乳酸菌 r16产苯乳酸的量最高，达到233.0mg/L。

通过形态学、生理生化、16S rDNA序列建树分析，初步鉴定分离自粪便的菌株r16和m15为植物乳杆菌，而菌株m343和m462为粪肠球菌，分别来自盲肠和小肠。已经有多株植物乳杆菌产苯乳酸的报道［1，11－13，17］，但肠球菌属产苯乳酸的报道不多，Valerio等［12］从 奶 酪 中 分 离 的 屎 肠 球 菌 ATCC882 (Enterococcus faecium)能产生15.0mg/L苯乳酸，而肠球菌属其它种，包括粪肠球菌还没有关于产苯乳酸的报道。本研究和其它研究表明［12，17］，苯乳酸可能是乳酸菌的普遍代谢产物，个体差异大，其产量取决于菌株个体。

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Isolation and identification of phenyllactic acid－producing LAB

LIU Chang－jian，LIU Qiu，JIANG Bo，SUN Tian－zhu，YAN Jian－fang
(College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China)

By the anaerobic culture，24 strains of lactic acid bacteria were obtained from pig’s caecum，small intestine，large intestine and feces，which could produce phenyllactic acid by HPLC.Seven strains produced 80～110mg/L phenyllactic acid(PLA)，and four strains could produce even more than 119mg/L PLA.Strain r16 from feces showed the highest PLA－producing ability(233.0mg/L).Based on 16S rDNA sequencing analysis，combining with its morphological，physiological，and biochemistry test，strain r16 and sain m15 were identified asLactobacillus plantarum，and stain m343 and strain m462 asEnterococcus faecalis.

pig;Lactic acid bacteria;phenyllactic acid;identification

TS201.3

A

1002－0306(2012)21－0192－04

2012－04－05

刘长建(1975－)，男，硕士，工程师，研究方向:应用微生物。

国家自然科学基金面上项目(31070005);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(DC120101031，DC120101034)。