滕 超，纪 烨，李秀婷，*

(1.北京工商大学食品学院，北京 100048;

2.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

产高活性木聚糖酶放线菌的筛选及其产酶条件的优化

滕 超1，2，纪 烨1，李秀婷1，*

(1.北京工商大学食品学院，北京 100048;

2.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

本研究采用平板透明圈法自土样中筛选出产木聚糖酶放线菌52株，其中酶活100U/mL以上的有12株。对其中产木聚糖酶酶活较高且产酶稳定的菌株F4712(初始酶活349.4U/mL)进行了液体发酵条件优化。实验首先对培养基成分包括碳源(种类及添加量)、氮源(种类及添加量)及发酵条件:温度、发酵初始pH、摇床转速以及发酵时间等因素进行了考察。通过Box－Behnken响应面分析对发酵产酶条件做进一步优化，确定了摇瓶发酵的最优条件。结果表明，最佳发酵条件为玉米芯水不溶性木聚糖(2.8%)，酵母浸膏(0.5%)及蛋白胨(1.0%)、45℃、pH6.2、130r/min以及6d。在此条件下酶活达693.4U/mL(较优化前提高了98.5%)。

放线菌，木聚糖酶，筛选，优化

广义木聚糖酶是指能够降解木聚糖的一组酶的统称，包括β－1，4－外切木聚糖酶，β－1，4－内切木聚糖酶和β－木糖苷酶［1］。木聚糖酶作为酶制剂行业中的一个重要产品，广泛应用于食品、造纸、饲料及纺织等多个行业［2］。这也是不断筛选新型酶源的重要意义所在。已发现的木聚糖酶种类繁多而且广泛存在于海洋及陆地，但因为获得难易程度及纯度的原因，当前商用木聚糖酶仍主要依靠微生物发酵获得［3］。已报道产木聚糖酶的微生物主要有细菌、放线菌、真菌、木霉、曲霉、青霉等。而国内外研究和应用最多的是细菌、曲霉、木霉所产的木聚糖酶［4］，放线菌(Actinomycete)作为原核生物的一个主要类群，虽然菌株产木聚糖酶水平略低于曲霉和木霉，但通常并不分泌纤维素酶，因此其具有较高的工业应用价值［5］。国内关于放线菌产木聚糖酶的报道较少，仅有的报道主要集中在放线菌中的链霉菌属。孙迅等［6］分离并筛选了一株产胞外木聚糖酶活力高的链霉菌(Streptomycessp.Strz－6)，酶活力为9.8U/mL;孙晓霞等［7］报道一株白色链霉菌(Streptomyces albus)产木聚糖酶活性为45.7 U/mL。李娥等［8］对链霉菌L2001利用农业废弃物发酵产木聚糖酶的条件进行了优化，结果木聚糖酶活力达498.8U/mL，为当前类似研究报道的较高水平。国外报道的链霉菌产木聚糖酶活力平均水平相对较高，Maheswari等［9］筛选的Strepto－myces cuspidosporus产木聚糖酶水平为146.0U/mL。Beg等［10］考察了Streptomycessp.QG－11－3产木聚糖酶的情况，优化后发酵水平可达到203.0U/mL。为了进一步开发和丰富产木聚糖酶放线菌的菌种来源，本实验对木聚糖酶高产放线菌株进行了高通量筛选，并对其中一株产酶较高菌株(F4712)的发酵条件进行了系统考察，对影响产酶水平的主要因素进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桦木木聚糖 美国Sigma公司;酵母提取物、蛋白胨、琼脂粉、柠檬酸、柠檬酸钠、酒石酸钾钠、3，5－二硝基水杨酸、碳酸钠、干酪素、羧甲基纤维素钠等 均为国产分析纯试剂;平板培养基(g/L) 酵母浸膏2，蛋白胨3，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾6，磷酸氢二钾1.5，琼脂20，玉米芯水不溶性木聚糖(200目)10，121℃灭菌20min;液体发酵培养基(g/L)碳源15，酵母浸膏5，蛋白胨10，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾6，磷酸氢二钾1.5，121℃灭菌20min;菌种保藏斜面培养基 PDA培养基。

超净工作台VD－1320 北京赛伯乐实验仪器有限公司;电子分析天平JA5003 上海天平厂;生化培养箱LRH－250 上海一恒科技有限公司;恒温摇床HQ45 中科院武汉科学仪器厂;pH酸碱度计PHS－3D Thermo公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 初筛方法 称取四川、贵州等地土样，分别用无菌水稀释至合适倍数，涂布于平板培养基上，40℃培养2～3d，利用透明圈法对产木聚糖酶菌株进行初筛。将疑似菌株于40℃条件下进行埋片培养，培养一定时间后分别取出埋片，用光学显微镜初步观察菌丝形态，对其进行初步鉴定。

1.2.2 发酵产酶条件单因素优化 250mL锥形瓶装液量50mL，接种后40℃、140r/min、初始pH6.0进行培养。在此基础上考察碳源种类(纤维素、淀粉、葡萄糖、果糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、玉米芯水不溶性木聚糖、麦皮、棉籽壳、玉米芯等，添加量为1.5%)，碳源粒度(40、60、80、100、200目)，碳源浓度(1%、1.5%、2%、2.5%、3%)，氮源种类［硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、尿素、牛肉蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸膏、胰蛋白胨、酵母提取物、复合氮a(酵母浸膏1.0%+牛肉蛋白胨0.5%)、复合氮b(酵母提取物1.0%+牛肉蛋白胨0.5%，浓度为1.5%)］，培养基的初始 pH (4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)，转速(120、140、160r/min)，温度(30、35、40、45、50℃)以及发酵时间(0、1、2、3、4、5、6、7d)对菌株产酶水平的影响。

1.2.3 响应面法优化产酶条件 根据单因素实验结果，确定影响木聚糖酶活的主要因素分别为A、B、C，根据Box－Behnken中心组合设计原理，设计三因素三水平共17个实验点，其中12个析因点，5个零点重复，用以估计实验误差。实验因素水平设计如表1所示。

1.2.4 木聚糖酶活力测定 木聚糖酶活力的测定参照DNS法［11］。

表1 实验因素水平表Table 1 Factors and levels of Box－Behnken design

1.2.5 纤维素酶、蛋白酶活力的测定 对于产木聚糖酶的菌株一般并不希望其产其它糖化酶，因此实验对菌株产纤维素酶的情况进行了考察。纤维素酶活力测定方法参照高润池等方法［12］。为考察菌株是否产蛋白酶而导致木聚糖酶降解，实验对菌株产蛋白酶的情况进行了考察。蛋白酶活力的测定参照标准GB/T 23527－2009进行。

2 结果与讨论

2.1 产木聚糖酶放线菌的筛选

实验采用透明圈法从土样中筛选出产木聚糖酶，确定平板透明圈较大的52株放线菌进行摇瓶发酵复筛，实验结果(表2)显示酶活力在100.0U/mL以上的有12株。

表2 产木聚糖酶放线菌初筛Table 2 Prescreening of Actinomycetes with xylanase activity

对发酵酶活较高的菌株进行反复发酵验证后，发现菌株F4712产木聚糖酶较高且稳定性较好，因此后续实验以 F4712作为研究对象，优化其产酶条件。

2.2 放线菌F4712产酶条件单因素优化

2.2.1 碳源种类对菌株产酶的影响 大部分木聚糖酶均为诱导性酶，因此碳源种类会直接影响菌株的产酶效果，实验考察了11种碳源对菌株产酶水平的影响，结果如表3所示。

由表3可知，菌株在以单糖及二糖为碳源发酵时，产酶水平普遍较低(小于10U/mL)。相比而言，利用含木聚糖农业废弃物进行诱导产酶时酶活较高(以棉籽壳及玉米芯为发酵碳源时酶活分别达到48.3U/mL及32.0U/mL)，但酶活仍低于50U/mL并且伴有纤维素酶的产生(约为木聚糖酶活力的8%)，同时结果也显示了在天然纤维质材料中木聚糖的利用方面，此菌株与一些真菌还存在一定差距［13］。实验显示玉米芯木聚糖为最佳诱导碳源，其诱导产酶能力远高于其它碳源，发酵酶活达到345.9U/mL。由于不同的农业废弃物中所含的木聚糖的种类和结构一般会存在着较大的差异，并且菌株利用结合态及游离态木聚糖的能力也有不同，这可能是导致不同碳源诱导产木聚糖酶能力存在明显差别的主要原因［14－15］。

表3 碳源种类对放线菌F4712产木聚糖酶影响Table 3 Effect of different carbon sources on xylanase production by Actinomycete F4712

2.2.2 碳源粒度对菌株产酶的影响 碳源粒度有可能直接影响微生物对碳源的分解程度和利用效果，因此实验在确定玉米芯木聚糖为最佳碳源后，继续考察碳源粒度对菌株产酶的影响，实验结果见图1所示。

图1 碳源粒度对放线菌F4712产木聚糖酶影响Fig.1 Effect of carbon source partical sizes on xylanase production by Actinomycete F4712

由图1可知，在玉米芯粒度为80目时，酶活力达到最大值364.9U/mL，比碳源粒度为40、60、100和200目时分别高出56%、17%、23%和31%。实验结果显示较大或较小的碳源颗粒均不适合菌株的诱导利用。

2.2.3 碳源浓度对菌株产酶的影响 碳源的主要作用是供给菌种生命活动所需要的能量以及作为构成菌体细胞成分和代谢产物中的来源，为微生物生长提供所需能量和构建细胞骨架。因此碳源浓度一般会直接影响对木聚糖酶的诱导效果，实验结果如图2所示。

从图2可知，随着碳源浓度的增加，发酵液中木聚糖酶量逐渐增加，当碳源浓度为2.5%时木聚糖酶活力达到最大为466.73U/mL。而后随着碳源浓度继续升高，木聚糖酶活力开始降低。碳源浓度太低不利于菌株的生长及碳源对木聚糖酶的诱导，而碳源浓度过高则会造成不必要的浪费，因此选择2.5%为实验的碳源浓度。

图2 碳源浓度对放线菌F4712产木聚糖酶影响Fig.2 Effect of carbon source concentration on xylanase production by Actinomycete F4712

图3 氮源种类对放线菌F4712产木聚糖酶影响Fig.3 Effect of different nitrogen sources on xylanase production by Actinomycete F4712

2.2.4 氮源对菌株产酶的影响 氮源不仅是菌体生长所必需的，而且是合成酶本身的前体来源，影响着酶的合成与分泌。一般来说，有机氮源培养要优于无机氮源［16］，但也有部分微生物利用无机氮源的能力要高于有机氮源［17］。实验在确定碳源种类、粒度及添加量后，继续考察氮源种类对菌株产酶效果的影响，实验结果如图3所示。由图3可知，有机氮源和无机氮源均可以使菌体生长和产酶，但相较而言有机氮源则更有利于菌体的生长和木聚糖酶的合成。以单一有机氮源为发酵氮源进行考察时，以酵母提取物为氮源时产酶效果最佳为431.0U/mL，牛肉蛋白胨和酵母浸膏次之;无机氮源中硝酸钠为最佳氮源，而以硫酸铵为氮源时产酶最低。发酵过程中产生的蛋白酶由于可以引起木聚糖酶的迅速降解，成为制约木聚糖酶发酵及储存的一个重要因素。因此实验同时也测定了发酵液中的蛋白酶活力，但实验结果显示无论是无机氮源还是有机氮源均不会诱导产生蛋白酶。另外，实验结果也显示，复合氮源的产酶效果要高于单一氮源，菌株在以复合氮源b为发酵氮源时木聚糖酶活达到675.7U/mL，高于以复合氮源a为氮源的产酶水平。但考虑到发酵成本等问题(酵母浸膏比酵母提取物相对廉价)，实验选择复合氮源 a(酵母浸膏1.0%+牛肉蛋白胨0.5%)为培养基组成氮源。

图4 初始pH对放线菌F4712产木聚糖酶影响Fig.4 Effect of initial pH on xylanase production by Actinomycete F4712

2.2.5 培养基初始pH对菌株产酶的影响 培养基初始pH不仅会影响到细胞膜所带的电荷，改变培养基中化合物的离子化程度，同时还有可能改变某些化合物分子进入细胞的状态，进而影响菌株的生长状态及产酶水平。实验在优化完培养基碳氮源种类及含量后，继续考察培养基初始pH对发酵效果的影响，实验结果如图4所示。由图4可知，培养基的初始pH对菌株产木聚糖酶的影响很大。实验发现放线菌F4712在pH4.5的酸性条件下虽然可以生产，但是酶的合成受到了明显抑制。随着培养基初始pH的提高，菌株发酵产木聚糖酶活力也随之增高，当pH介于5.5～6.5时比较利于菌株合成木聚糖酶，在pH6.0时，木聚糖酶活力达到最大值为612.09U/mL。然后随着pH升高，木聚糖酶活力开始下降，当pH达到8.0时，酶活力仅为最高值的10%左右。另外，实验还发现当培养基初始pH为4.5或大于7.5时，菌株生长状态较差。而当pH介于5.5～6.5时，菌株生长旺盛，发酵液比较粘稠，此结果说明该菌株在培养基为中性偏弱酸时发酵产酶效果高。因此选择合适初始pH对获得较好的产酶效果至关重要。

2.2.6 摇床转速对菌株产酶的影响 摇床转速的高低直接影响发酵过程中培养基中溶氧的多少，继而影响菌的生长状态。实验继续考察了摇床转速对产酶水平的影响，实验结果如图5所示。

图5 摇床转速对放线菌F4712产木聚糖酶影响Fig.5 Effect of rotation rate on xylanase production by Actinomycete F4712

由图5可知，摇床在140r/min的条件下，菌株产木聚糖酶的效果最大，酶活力达到592.7U/mL，分别比120r/min和160r/min时产木聚糖酶的效果高20%和31%。

2.2.7 温度对菌株产酶的影响 在确定最佳碳氮源、培养基初始pH和转速的条件下，考察温度对菌株产酶的影响。培养温度过低和过高均会影响菌株的生长，培养温度过低，菌体生长缓慢且发酵时间长，产酶效果低;而温度过高会导致菌体生长过于迅速，菌丝体很容易老化，同样不利于木聚糖酶的合成和分泌。实验结果见图6。

图6 温度对放线菌F4712产木聚糖酶影响Fig.6 Effect of temperature on xylanase production by Actinomycete F4712

由图6可知，随着培养温度的升高，菌株所产木聚糖酶酶活逐渐增加，在发酵温度为40、45℃时发酵酶活分别达到600.7U/mL及660.9U/mL。继续升高培养温度，酶活力迅速下降。

2.2.8 发酵时间对菌株产酶的影响 实验在确定所有发酵条件后，最后对菌株F4712的产酶历程进行了考察和确定，实验结果如图7所示。

图7 发酵时间对放线菌F4712产木聚糖酶影响Fig.7 Effect of incubation time on xylanase production by Actinomycete F4712

前期实验显示菌株在温度40、45℃时产酶效果相当，因此实验同时考察了菌株在这两个温度下的产酶历程。实验结果显示，菌株在两个温度下产酶趋势类似，同样在发酵第6d时达到最大值。其中在发酵温度为45℃时产酶达到最大值675.0U/mL。另外，实验也发现发酵瓶壁自培养的第3d开始有淡蓝色的菌丝附着，随着时间延长附着菌丝越来越厚，发酵液也越来越粘稠。至发酵第6d发酵酶活停止增长且之后略有下降。

2.3 放线菌F4712产酶条件响应面分析

根据单因素实验结果得出碳源浓度、培养基初始pH和摇床转速分别为影响菌株产木聚糖酶活力的三个重要因素，并按照Box－Behnken设计法每个因素取三个水平，以(－1，0，1)编码进行实验。三因素三水平共17组实验。实验方案与结果见表4。

根据表4的实验结果，使用用Design Expert7.1.3软件进行方差分析和二次回归拟合实验数据，回归方程变量分析表见表5。

以Y木聚糖酶活力(U/mL)为响应面值，以A (碳源浓度)、B(pH)、C(转速)为自变量，拟合得到多元二次回归方程:Y=618.40+123.50A+30.63B－103.88C+64.50AB+87.00AC+15.25BC－111.07A2－96.32B2－75.33C2。由回归方程系数显著性检验表及方差分析可知，模型实验拟合良好，模型的p=0.0001＜0.05，表明该实验模型显著，失拟项p=0.0721＞0.05，说明方程对实验的拟合度较好，此方法可靠。表5表明各因素对木聚糖酶活力的影响不同，其中碳源浓度的影响最大，其次是转速的影响，均达到极显著水平，培养基初始pH对木聚糖酶活力无显著影响;AB、AC对木聚糖酶活力效应显著，而BC交互作用不显著。A2、B2、C2对Y值的影响达极显著水平，表明实验因子对响应值不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大的关系。模型的R2=0.9712，说明回归方程的拟合程度良好，失拟较小。

表5 回归方程变量分析表Table 5 Variance analysis of regression equation

表4 放线菌F4712产木聚糖酶的Box－Behnken design实验设计和结果Table 4 Experiment design and results of the Box－Behnken design for xylanase production

由图8可知，在摇床转速(140r/min)一定的条件下，木聚糖酶活力随碳源浓度的增加和初始培养基pH的减少而先增加后减少，两者交互作用显著，且碳源浓度对木聚糖酶活力的影响比初始培养基pH显著。

图8 碳源浓度和培养基初始pH交互作用因素间交互作用的响应面图Fig.8 Response surface of the combined effects (concentration of corncob and initial pH)

由图9可知，在初始培养基pH(6.0)一定的条件下，木聚糖酶活力随碳源浓度的增加呈先上升后下降的趋势，而随摇床转速的降低而增加，并达到一定酶活力后变化趋于平缓。两者交互作用显著。由图10可知，在碳源浓度(2.5%)一定的条件下，木聚糖酶活力随培养基初始pH的增加呈先增加后减少的趋势，而随摇床转速的降低而增加，并达到一定酶活力后变化趋于平缓。

图9 碳源浓度和摇床转速交互作用的响应面图Fig.9 Response surface of the combined effects (concentration of corncob and rotation rate)

对回归方程求解可知木聚糖酶活力的最佳优化条件是:碳源浓度2.75%，初始培养基pH 6.15，摇床转速为132.55r/min，此时模型预测的最大木聚糖酶活力值为672.911U/mL。对模型验证(为操作方便取最佳参数为:碳源浓度2.8%，初始培养基pH6.2，摇床转速为130r/min)，进行3次重复验证实验确定木聚糖酶酶活为693.4U/mL与预测值偏差2.95%，无显著差异。酶活力值较原始培养条件下酶活提高了98.5%。

图10 培养基初始pH和摇床转速交互作用的响应面图Fig.10 Response surface of the combined effects (initial pH and rotation rate)

3 结论

实验收集称取四川、贵州等地几十份土样，通过透明圈法筛选出一株产酶效果高的放线菌F4712。对菌株发酵条件进行了单因素及响应面优化，确定链霉菌F4712最佳产木聚糖酶的发酵条件为:最适碳源为80目玉米芯水不溶性木聚糖(2.8%)，最适氮源为牛肉蛋白胨(1.0%)+酵母浸膏(0.5%)，最适培养基初始pH为6.2，最适摇床转速为130r/min及最适培养温度为45℃。在此条件下培养6d，木聚糖酶的活力达693.4U/mL，较初始酶活提高98%以上。

［1］ KulkarniN，Shendye A，Rao M.Molecular and biotechnological aspects of xylanase［J］.FEMS Microb Rev，1999，23(4):411－456.

［2］万红贵，王涛，蔡恒，等.木聚糖酶的特性及应用研究［J］.食品发酵工业，2008，34(3):92－95.

［3］李秀婷.微生物木聚糖酶及在食品工业中的应用［J］.农业机械学报，2008，39(2):175－179.

［4］怀文辉，何秀萍，郭文杰，等.微生物木聚糖酶降解酶研究进展及应用前景［J］.微生物学通报，2000，27(2):137－139.

［5］Kusakabe I，Kawaguchi M，Yasui T，et al.Purification and some propertiesofextracellularxylanasefrom Streptomyces olivaceovirdis E－86［J］.J Agr Chem Soc，1997，51(2):429－437.

［6］孙迅，朱陶，朱启忠，等.产胞外木聚糖酶放线菌的分离与筛选［J］.微生物学杂志，1998，18(12):29－32.

［7］孙晓霞，谢响明，吴玉英，等.白色链霉菌产木聚糖酶规律及其耐热碱性的初步研究［J］.北京林业大学学报，2005，27 (3):72－75.

［8］李娥，李秀婷，朱运平，等.链霉菌L2001利用农业废弃物产木聚糖酶条件及酶解产物［J］.中国食品学报，2011，11(4): 24－32.

［9］Maheswari M U，Chandra T S.Production and potential applications of a xylanase from a new strain of Streptomyces cuspidosporus［J］.World J Microbiol Biotechnol，2000，16: 257－263.

［10］Beg Q K，Bhushan B，Kapoora M，et al.Enhanced production of a thermostable xylanase from Strepto－myces sp.QG－11－3 and its application in biobleaching of eucalyptus kraft pulp［J］.Enzyme Microb Technol，2000，27:459－466.

［11］Bailey M J，Biely P，Poutanen K.Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity［J］.J Biotechnol，1992，23 (3):257－270.

［12］高润池，王晓燕，孟艳芬，等.耐高温中性纤维素酶高产菌的筛选及发酵条件研究［J］.食品工业科技，2009，30(8): 165－169.

［13］张新峰，王伟平，汪蓉，等.培养基的优化及部分酶学性质的研究［J］.食品工业科技，2011，32(10):249－252.

［14］李勇如，李秀婷，孙宝国，等.米曲霉利用农业废弃物产木聚糖酶的条件优化［J］.北京工商大学学报:自然科学版，2010，28(5):18－23.

［15］宋红霞，李秀婷，孙宝国，等.微生物利用木质纤维原料产木聚糖酶研究现状［J］.北京工商大学学报:自然科学版，2011，29(2):63－69.

［16］李坤平，潘天玲，黄克瀛.β－聚糖酶的诱导合成Ⅱ:初始pH与培养温度的影响［J］.广东药学院学报，2003，19(4): 310－311.

［17］Haltrich D，Nidetzky B，Kulbe K D，et al.Production of fungal xylanases［J］.Bioresource Technol，1996，58:137－161.

Screening of high－yield xylanase－producing Actinomycetesp.and optimization of its fermentation conditions

TENG Chao1，2，JI Ye1，LI Xiu－ting1，*
(1.School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China;
2.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology＆Business University(BTBU)，Beijing 100048，China)

52actinomyceteswere isolated from the soil samples of different districts of China based on plate screening method，and 12 strains was obtained with enzyme activity over 100U/mL.ActinomyceteF4712 with high xylanase－producing(the initial enzyme activity was 349.4U/mL)was selected for further research.The conditions including:carbon source，nitrogen source，initial pH value，rotation rate，temperature and cultivation time were investigated by single－factor experiment.Box－Behnken was utilized to the response surface analysis to determine the conditions further，which were insoluble corncob xylan 2.8%，a combination of beef peptone 1.0%and yeast extract 0.5%，pH 6.2，130r/min，45℃and 6 days.The xylanase activity was 693.4U/mL under the optimal conditions，which was improved by 98.5%compared to the original activity.

actinomyces;xylanase;screening;optimization

TS201.3

A

1002－0306(2012)21－0172－06

2012－03－26 *通讯联系人

滕超(1981－)，男，博士，讲师，研究方向:食品生物技术。

国家自然科学基金项目(31071511);北京市属高等学校人才强教计划资助项目(PHR 20110872)。