徐 勇，蔡 鹏，范 丽，杭 琪，勇 强，2，余世袁，2

(1.南京林业大学化工工程学院，江苏南京 210037;

2.林木遗传与生物技术教育部重点实验室，江苏南京 210037;

3.江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室，江苏南京 210037)

纤维素酶系碱性条件下的选择性失活及应用

徐 勇1，2，3，蔡 鹏1，2，3，范 丽1，2，3，杭 琪1，勇 强1，2，余世袁1，2

(1.南京林业大学化工工程学院，江苏南京 210037;

2.林木遗传与生物技术教育部重点实验室，江苏南京 210037;

3.江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室，江苏南京 210037)

里氏木霉产纤维素酶系中的内切葡聚糖酶(CMCase)、纤维二糖水解酶(CBH)和β－葡萄糖苷酶三大酶类在碱性处理条件下会发生快速、选择性失活。在pH9.00和(25±1)℃的条件下静置处理纤维素酶液30min，CMCase和CBH酶组分主要发生可逆变性失活，而β－葡萄糖苷酶发生不可逆变性失活，它们的残余酶活力分别为58.8%、56.6%和5.7%，相对比例可达到10.3和9.9。通过碱性处理能够得到低β－葡萄糖苷酶活力的纤维素酶制剂，可以显著提高其定向酶水解纤维素制备纤维低聚糖的生产性能，并生成以纤维二糖为主包括少量纤维三糖的纤维低聚糖。以0.1% (v/v)碱处理纤维素酶定向水解10g/L纸浆24h，纤维低聚糖的酶解得率为6.73%，占总糖类的78.2%，比天然酶反应体系提高53.6%。

纤维素酶系，里氏木霉，酶选择性失活，定向酶水解，纤维低聚糖

里氏木霉(Trichoderma reesei)是研究和制备纤维素酶最常用的经典菌株之一［1－2］，通过底物的诱导和发酵调控作用它可以分泌出多种不同类型的聚糖水解酶蛋白组分，进而组成不同的酶系或复合酶系。其中纤维素酶系中主要包括内切葡聚糖酶(endo－1，4－β－D－glucanase，EC3.2.1.4，简称EG)、外切葡苷聚糖酶(exo－1，4－β－D－glucanase，EC3.2.1.91，又称CBH)和纤维二糖酶(β－1，4－D－glucosidase，EC3.2.1.21，又称β－葡萄糖苷酶，简称β－G或BG)三大酶系，目前已经共发现了8个EG(EGI～EGVIII)、2个CBH(CBHI和CBHII)和7个BG(BGI～BGVII)酶家族［3－5］。在木质纤维原料聚糖类的酶水解过程中，通过上述三大酶系的协同作用可以催化纤维素或半纤维素为聚糖最终水解生成单糖［2－3，5］。随着功能性多糖和低聚糖类在细胞生物合成和调控、食品、保健品、医药和饲料等领域的基础研究和应用的快速发展，聚糖定向酶水解技术的研究和开发备受关注，对具有单一功能或催化活性的酶家族或酶组分的需求日益增长［6－8］。目前采用的主要技术途径一是通过外源单一内切酶或外切酶基因的重组表达，二是对天然酶制剂进行蛋白质拆分以控制和除去纤维素系中的BG酶组分［3，8－9］，它们在大规模工业化生产中存在着技术复杂、研发周期长、设备及操作要求高、前期投入和运行成本高等不足，因此寻求简单低廉的酶组分活力的定向控制技术和方法具有重要的理论和实用价值［3，10－12］。本研究以里氏木霉产天然纤维素酶复合酶系为实验材料，采用简单的pH处理的方法对其三大酶系进行选择性失活处理，并对处理后酶制剂的多聚糖定向酶水解性能进行了检测和分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

里氏木霉(Trichoderma reeseiRut C－30) 南京林业大学选育保藏;色谱检测用葡萄糖和纤维低聚糖的标准品 德国Magazyme公司;蛋白质电泳测定用标准物(SM0431) Fermentas生命科学公司;其它试剂 Sigma公司和上海国药集团。

高效液相色谱仪 配备Bio－Rad HPX－87H色谱柱(7.8mm×300mm)及保护柱，美国Agilent 1200;高效液相离子交换色谱仪 配备CarboPacTMPA200阴离子交换色谱柱(3mm×250mm)及保护柱，美国Dionex ICS－3000;E24R型台式恒温振荡摇床 美国NBS公司;723N型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R型冷冻离心机 美国热电公司;Memmer WNB22恒温振荡水浴 德国美尔特公司;Tanon 3500R全自动数码凝胶图像分析系统 上海天能公司。

1.2 实验方法

1.2.1 纤维素酶发酵制备 采用Mandels营养盐添加12g/L纸浆和蒸汽爆破玉米秸秆混合底物为碳源［13］，在250mL玻璃摇瓶中装液45mL并接入5mL活化后的里氏木霉菌丝体，于30℃和170r/min振荡发酵产酶96h得发酵液，经4000r/min离心10min后取上清液即得到纤维素酶原液，分装后冷冻保藏备用。

1.2.2 酶活力测定 采用双平行实验，控制平行误差≤5%。滤纸酶活力、内切葡聚糖酶活力(CMCase)、外切葡聚糖酶活力(CBH)［14］均采用DNS法测定，β－葡萄糖苷酶(BG)采用对硝基苯酚葡萄糖苷法测定［15］。上述各种酶活力测定均采用0.05mol/L柠檬酸—氢氧化钠缓冲液体系(pH4.80)和(50± 1)℃。纤维素酶原液中上述各种酶活力值依次为5.81FPIU/mL，38.01、3.60、1.13IU/mL。

1.2.3 酶组分碱性失活 采用双平行实验，控制平行误差≤5%。在恒温水浴和温和搅拌的条件下，向纤维素原酶液中缓慢滴加少量10%(v/v)NaOH溶液，调节pH至稳定值，密封静置处理一定时间后得处理后的酶液，再采用酶活力测定方法重新测定处理后酶液的三种酶组分的酶活力。残余酶活力的计算方法:以处理前后酶液的各种酶活力测定值相对百分比来表示。碱性处理后纤维素酶液离心分离实验条件:8000r/min离心碱性处理后的纤维素酶液10min后完全倾出离心上清液，以10%(v/v)体积的柠檬酸缓冲液(pH4.80)清洗离心管壁得离心沉淀物。

1.2.4 酶组分的SDS－PAGE检测 浓缩胶浓度5.0%，分离胶浓度12.0%，上样量10μL，样品蛋白质上样浓度为0.1～1.0mg/mL，电场强度120V/cm。电泳时间浓缩胶20min，分离胶60min。

1.2.5 酶水解性能的检测 采用双平行实验，控制平行误差≤5%。在100mL螺口玻璃三角瓶中进行，加入0.05mol/L柠檬酸缓冲液(pH4.80)配制而成的10g/L Whatman滤纸纸浆粉(20目)溶液25mL作为酶解底物，再加入适量酶液并密封，于(50±1)℃和100r/mim振荡反应。定时取样0.5mL加入10μL的1%(v/v)H2SO4终止酶反应得酶水解产物，经适当稀释后进行色谱分析。酶解得率计算:以水解反应体系中所测定的产物糖的物质浓度除以纸浆的初始物质浓度再乘以转换系数0.9。

1.2.6 酶水解产物的色谱分析 葡萄糖的测定依照NREL方法［16］采用高效液相色谱法;纤维低聚糖的分析测定采用高效液相离子交换色谱—脉冲安培法［17］。

2 结果与讨论

2.1 纤维素酶系的碱性条件下失活机制

在25℃的恒温条件下，直接添加4.0%NaOH试剂(w/w)调节纤维酶系的pH并静置处理60min后，测定三大酶组分的酶活力变化规律如图1－a所示。

结果显示，在不同pH的碱性处理条件下，三大酶类的酶活力呈现出两种不同类型的变化特征。以pH8.00以分界点，CMCase为两段阶梯式变化，而CBH和BG则为线性衰减。pH5.00～7.00的范围内，CMCase和 CBH的酶活力相对较为稳定，可保留90%以上，而BG酶类的酶活力稳定性略低，继续提高pH导致CBH和BG的酶活力快速线性下降。在高于pH8.00的环境中CMCase的酶活力相对较为稳定。当pH增至9.00时，BG的残余酶活力仅为5.6%，而 CMCase和 CBH仍然可残留 57.0%和52.1%，CMCase、CBH与β－G的残留酶活力的相对比率分别为10.3和9.4;至pH10.00时，可以基本上消除BG和90%以上的CBH酶活力，但仍然可以保留48.4%的CMCase酶活力，即可以得到几乎不含BG酶活力的纤维素酶制剂。

图1 纤维素酶系碱性失活规律和最适pH的测定Fig.1 Denaturation of cellulase system by alkali treatment and optimum pH value determination

与碱性条件处理相比，最适pH的测定结果表明(图1－b)，随着酶反应体系pH的升高，三种酶组分的相对活力同步衰减，即直接调控酶反应体系的pH不能达到选择性三大酶组分活力的效果。采用Bradford方法测得碱性处理前后的纤维素酶液中总溶解蛋白质的浓度基本不变;CMCase、CBH和BG酶的蛋白质分子量范围大约为25～120ku［3－5］，SDSPACE电泳结果显示碱处理前后的纤维素酶系蛋白质谱带也未发生明显的变化，仅有少量酶蛋白因离心作用会附着在管壁上(图2)。

图2 纤维素酶经碱性处理后的电泳图谱Fig.2 Electrophonic map of alkali treated cellulase

强碱条件导致酶失活的途径主要有两个方面:一是酶构象改变进而导致失活;二是影响底物、酶蛋白分子空间结构中的有关基团或中间络合物ES的解离状态，进而导致影响酶的活性或致使底物和酶难以结合，最终影响了酶活力。基于本研究的结果，对天然纤维素酶系碱性条件下的选择性失活机制作如下推测:较强的碱性条件会使纤维素酶系中的三大酶类均产生蛋白质变性作用，进而导致它们同步失活;由于体系的高pH远离了它们各自的等电点，各酶蛋白之间存在着同电排斥作用，所以并不会产生沉淀，表现为处理前后的总蛋白质浓度和电泳图谱无明显的差异;在pH≥8.00的碱性处理条件下，三大酶类中的CMCase和CBH酶类主要产生可逆变性失活(构象变化)，而BG为不可逆变性失活。当将碱处理后的纤维素酶重新加入到pH4.80的缓冲体系测定酶活力时，CMCase和CBH的构象部分复性并且重新表现出相应的酶活力，而BG的构象和酶活力较难以恢复，最终通过碱性处理可达到纤维素酶系选择性失活的效果。

2.2 处理温度和时间对酶系失活的影响

在pH9.00的条件下，将纤维素酶原液分别置于5～40℃恒温水浴条件下同步静置处理60min。由图3－a可知，在pH9.00的碱条件下，低于10℃的处理温度对BG酶组分存在一定的保护作用，在15～30℃的温度范围内碱性pH对纤维素酶液都起到较好的选择性失活作用，但是超过 30℃的温度也会导致CMCase和CBH的残余酶活呈现出下降的趋势。这有利于纤维素酶在常温下进行碱处理操作。图3－b显示，在pH9.00和(25±1)℃的条件下处理30min后，三种酶类的残余酶活力就可以达到稳定状态，其中CMCase、CBH和BG的残余酶活力分别为58.8%、56.6%和5.7%，相对比例达到10.3和9.9，可实现选择性失活的效果。碱处理时间超过 70min后，CMCase和CBH的酶活力会表现出下降的趋势。

图3 处理温度和时间对纤维素酶系碱性失活的影响Fig.3 Effects of temperature and time on cellulase denaturation by alkali treatment

综上可见，相对于其它的酶分离和酶活力调控技术而言，碱性处理可以在常温条件下快速实现天然纤维素酶系的选择性失活，具有设备简单、操作方便和成本低廉的技术优势，在特定纤维素酶制剂的生产和应用上具有发展前途。

2.3 碱性条件下失活酶系的酶水解性能

分别采用pH9.00和pH10.0的两种碱性条件在(25±1)℃处理纤维素酶液30min后得到处理后的酶液。以纤维素酶原液为对照，在10g/L纸浆的酶解体系中分别加入0.1%(v/v)用量的两种酶液，比较3种酶制剂的酶水解反应历程如图4所示。

图4 碱性条件下处理前后纤维素酶水解动力学的比较Fig.4 Comparison of enzyme kinetics of three enzymes solution

由图4可知，在低底物和较少酶用量的反应条件下，与原酶液相比，经过pH9.00碱处理后的酶制剂仍然可保存50%以上的CMCase和CBH酶活力，二者对纸浆酶水解反应的动力学和总糖得率基本上相近。由于碱处理可选择性地抑制酶系中BG酶活力(残余酶活力5%左右)，因而可以有效地保护纸浆酶水解过程中生成的纤维低聚糖组分。0.1%(v/v)用量的碱处理酶催化水解10g/L纸浆反应24h后，反应体系中各种酶解产物组成基本趋于稳定，对应的总糖酶解得率为8.60%，其中纤维低聚糖的酶解得率为6.73%，低聚糖占总糖的比例由原酶液的50.9%增长到78.2%，提高幅度达到53.6%。这说明，碱性处理对天然纤维素酶系的选择性失活作用可显著提高定向水解纤维素制备纤维低聚糖的生产性能，可用于纤维低聚糖的酶法生产。提高酶液碱度至pH10.0会导致三大酶类进一步失活，尤其是CBH显著失活，造成酶水解性能和低聚糖的得率大幅度下降，但对酶解产品品质即低聚糖比例的贡献较小。

采用高效离子液相色谱对酶解产物糖组成的分析结果显示(如图5)，采用碱失活纤维素酶水解纸浆只生成纤维二糖和少量的纤维三糖，不会生成其它聚合度的纤维低聚糖，两种糖分别约占总低聚糖类的90%和10%。

3 结论

3.1 在pH≥8.00的碱性条件下，纤维素酶系中的CMCase和CBH酶类主要产生可逆变性失活，而BG为不可逆变性失活，可采用碱性处理对纤维素酶系的三大酶类进行性失活。

3.2 碱性处理可以在常温条件下实现天然纤维素酶系的快速、选择性失活，设备和操作简单、成本低廉。在pH9.00和(25±1)℃的条件下处理30min后，纤维素酶系中CMCase、CBH和BG的残余酶活力分别为58.8%、56.6%和5.7%，相对比例可达到10.3和9.9。

图5 碱处理纤维素酶定向水解纸浆的糖组成Fig.5 Degraded saccharides composition of selective hydrolyzed paper with alkali treated cellulase

3.3 碱性处理可显著提高纤维素酶定向水解纤维素制备纤维低聚糖的生产性能，可用于纤维低聚糖的酶法生产。以0.1%(v/v)碱处理纤维素酶定向水解10g/L纸浆24h生成以纤维二糖为主包括少量纤维三糖的纤维低聚糖，对应低聚糖类的酶解得率为6.73%并占总糖类的78.2%，较天然酶反应体系可提高53.6%。

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Selective denaturation of major enzymatic components in cellulase system by alkali treatment and its application

XU Yong1，2，3，CAI Peng1，2，3，FAN Li1，2，3，HANG Qi1，YONG Qiang1，2，YU Shi－yuan1，2
(1.College of Chemical Engineering，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China;
2.Key Laboratory of Forest Genetics＆Biotechnology MED，Nanjing 210037，China;
3.Jiangsu Key Lab of Biomass－based Green Fuel＆Chemicals，Nanjing 210037，China)

In the crude cellulase system ofTrihcoderma reesei，three main enzyme groups involving endoglucanase(CMCase)，cellobiohydrolase(CBH)and β－Glucosidase were rapidly and selectively denatured in the alkali circumstance.CMCase and CBH were inclined to reversible denaturation，different from the irreversible denaturation of β－Glucosidase as the crude cellulase was incubated statically in the alkali solution at pH9.00 and (25±1)℃for 30min.The residual enzyme activity value of three enzyme groups were respectively remained 58.8% of CMCase，56.6%of CBH and 5.7%of β－Glucosidase，thus the relative ratio between CMCase or CBH and β－Glucosidase reached 10.3 or 9.9.Alkali treatment improved greatly，the cellulase selectivity and produced the glucosidase－poor cellulase to hydrolyze selectively cellulose into cellooligosaccharides containing mainly cellobiose and little cellotriose.The product yield of cellooligosaccharide could reach 6.73%when 10g/L paper powder solution was hydrolyzed at the enzyme loading of 0.1%(v/v)alkali treated cellulase for 24h.The oligosaccharides content accounted for 78.2%of the total degraded saccharides which increased by 53.6%，compared with the enzymatic hydrolysate with crude cellulase.

cellulase system;Trichoderma reese;selective denaturation of enzyme;selective enzymatic hydrolysis; cellooligosaccharides

Q814.1

A

1002－0306(2012)21－0164－05

2012－04－06

徐勇(1971－)，男，博士，副教授，研究方向:生物工程。

林业公益项目(200904017);国家自然科学基金项目(31070514);江苏省重大科技支撑项目(BEK2011838);江苏省高校科技创新团队资助项目;江苏省高校优势资源学科建设工程资助项目。