黄玉玲，王桂峰，隆小华，*，刘兆普，王 琳，王 博

(1.南京农业大学江苏省海洋生物学重点实验室，江苏南京 210095;

2.山东省农垦科技发展中心，山东济南 250014)

产菊粉酶菌株的筛选及产酶条件优化

黄玉玲1，王桂峰2，隆小华1，*，刘兆普1，王 琳1，王 博1

(1.南京农业大学江苏省海洋生物学重点实验室，江苏南京 210095;

2.山东省农垦科技发展中心，山东济南 250014)

从盐碱地菊芋根际土壤中筛选出112株产菊粉酶菌株，并从中得到一株酶活较高的真菌A－6，经菌落观察以及采用真菌通用引物ITS1和ITS4 PCR扩增RNA基因序列，测序鉴定结果为烟曲霉Aspergillus fumigatus。对其产酶条件进行单因素分析结果显示，真菌A－6的pH耐受范围较广，且具有一定的耐盐性。经正交实验进行产酶条件优化，确定了A－6的最佳产酶条件为菊芋提取液(EJA)100g/L，酵母膏(YE)25g/L，NaCl为5g/L，NH4H2PO45g/L，pH为5，30℃，170r/min下振荡培养3d，酶活最高为13.29U/mL。

筛选，菊粉酶，烟曲霉，产酶条件，优化

菊芋(Helianthus tuberosus)又名洋姜，适应性广、耐贫瘠、耐盐碱。菊芋块茎中80%为菊粉(Inulin)。菊粉又称菊糖，是一种果聚糖，由果糖在1分子蔗糖上以β－2，1连接而成，聚合度30左右［1］，分子量3000～5000碳单位。菊粉可水解生成果糖，酸法水解产量较高，但成本高且无机离子含量高。酶法水解具有方法简便、成本低、产物纯度高的优点，所以菊粉酶的研究成为热点［2－3］。八十年代，国外便开始了酶法水解菊粉生产果糖浆的研究，先后开展了菌株筛选、酶学性质以及工业生产固定化技术等研究［4－5］。我国菊粉酶的相关研究起步较晚，但大部分工作仅停留在菌株筛选以及酶学研究阶段，但由于产酶量和某些作用机制的问题［6］，尚未有成功应用于工业发酵生产的报道，因此进一步筛选性能优良的高产菌株仍然十分必要。菊粉酶(Inulinase)能够通过外切或内切的方式水解菊粉，分别生成低聚果糖或果糖［7］。多种微生物如酵母菌、霉菌和细菌均能合成菊粉酶［8］。国内外菊粉酶菌株的研究主要集中在霉菌和酵母两类真菌，酵母菌中研究最多的是子囊菌亚门的克鲁维酵母属(Kluveromyces)［9－10］。霉菌的研究主要集中在曲霉(Aspergillus)［11－12］、青霉属(Penicillium)［13］。本研究旨在筛选高产野生产菊粉酶菌株，通过单因子分析和正交实验，对其进行产酶发酵条件的摸索与优化，为以后酶学性质的研究，菊粉酶基因的克隆和工程菌转化等进一步研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

筛菌样品 采自江苏大丰、山东东营、黑龙江大庆的菊芋根际土壤;菊芋块茎 取自江苏大丰南京农业大学菊芋中试基地;菊芋提取液(EJA) 将粗菊粉与蒸馏水按1∶4比例混匀，80℃热浸提1h压滤;菊粉 分子量约5000，购于德国Fluka公司;果糖、3，5二硝基水杨酸(DNS) 国药集团化学试剂有限公司，分析纯;其他试剂 均为化学纯;初筛培养基(g/L) 菊芋提取液(EJA)70，K2HPO41.0，MgSO4· 7H2O 0.5，NaNO31.5，NH4H2PO42.0，KCl 0.5，FeSO4· 7H2O 0.1，琼脂20，pH6;115℃湿热灭菌30min;复筛培养基(g/L) 菊芋提取液120，蛋白胨10，NH4H2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 5.0，pH6; 115℃湿热灭菌30min;斜面保藏培养基(PDA，g/L)

马铃薯200、葡萄糖15、琼脂20。

1.2 菌株筛选

1.2.1 菌株初筛 称取一定量的土样置于含有无菌水和玻璃珠的三角瓶中，30℃，170r/min摇床振荡30min，吸取一定量的土壤悬液于初筛培养基，涂布平板并在28℃下培养2～7d，挑取透明圈直径大的菌落，接种至PDA平板培养基上进行分离纯化后，斜面保存备用。

1.2.2 复筛实验 将初筛得到的菌株，接入装有50mL复筛培养基的三角瓶中。真菌的接种量为直径0.5cm的菌落，30℃，170r/min摇床培养72h后，用滤纸过滤，弃出菌丝，得到粗酶液。细菌接入量为5%(v∶v)，37℃，170r/min摇床培养24h后，将发酵液10000r/min离心15min，取上清液即为粗酶液。测定粗酶液酶活，从中选取酶活较高的菌株。

1.3 酶活的测定［14］

取适当稀释的粗酶液0.2mL与0.8mL 2%菊糖(用0.1mol/L，pH4.6醋酸缓冲液配制)在55℃条件下反应20min后，于100℃加热5min终止酶反应，然后取1mL的反应液用DNS显色法［15］测定产物中还原糖的量。在相同的条件下，用100℃灭活的粗酶液作为对照。菊粉酶酶活力定义为pH4.6，55℃下反应20min，每分钟转化成1μmol还原糖的酶量为一个酶活单位。

1.4 菌株鉴定

1.4.1 菌落观察 采用点植孢子悬液的方法，制备一定浓度的孢子悬液，用接种环或移液枪分别点种在培养基上(重复5板)，并将此平板倒置于28℃恒温培养，连续几天跟踪观察菌落特征。

1.4.2 分子生物学鉴定 将平板中培养的菌种转接到装有50mL PDA液体培养基的三角瓶中，30℃，170r/min培养5d后，过滤，取菌丝加液氮充分研磨后，迅速转移至1.5mL离心管中，采用OMEGA公司的E.Z.N.ATM.真菌提取试剂盒进行提取基因组DNA。

采用通用引物进行真菌核糖体RNA的PCR扩增:其中ITS rDNA扩增引物为 ITS1和ITS4［16］，ITS1的碱基序列为5'－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3'，ITS4碱基序5'－TCCTCCGCCTTATTGATATGC－3'［17］。PCR扩增体系为:10×buffer(不含Mg2+)5μL，dNTPs (各2.5mmol/L)4μL，引物各1μL，模板4μL，MgCl2(25mmol/L)2.5μL，Taq酶(2.5U)0.1μL，加ddH2O至50μL。PCR条件为:94℃预变性3min;94℃变性30s; 50℃退火45s;72℃延伸1min;35个循环;72℃延伸7min。PCR产物于0.8%琼脂糖胶电泳检测后4℃保存待测，测序工作均由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.5 产菊粉酶条件的优化

1.5.1 单因素实验

1.5.1.1碳源对产酶的影响 将菌种接于装有100mL复筛培养基的三角瓶中，分别用20g/L的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、乳糖、玉米面、菊粉、菊芋提取液作为单一碳源，30℃，170r/min下振荡培养3d后分别测定酶活，选取最佳碳源。

1.5.1.2 氮源对产酶的影响 采用上述实验所得最佳碳源，分别用20g/L的酵母膏、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏和5g/L的NH4H2PO4、NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NH3为氮源，培养条件同上测定酶活，选取最佳氮源。

1.5.1.3 无机盐对产酶的影响 采用上述实验所得最优碳源和氮源，分别采用不同的无机盐:5g/L的NaCl、KCl、CaCl2，0.1g/L的MgSO4·7H2O、CuSO4· 5H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4、ZnSO4·7H2O，其他条件同上测定酶活，选取最佳无机盐。

1.5.1.4 pH对产酶的影响 上述各因素确定后，采用不同的初始pH3、4、5、6、7、8、9，培养后测定酶活，确定最佳的初始pH。

1.5.2 正交实验 根据上述单因素实验结果，确定对酶活影响较大的几个因素，如表1采用L16(44)正交表对菊芋提取液、酵母膏、NaCl的浓度和pH进行正交实验，以确定最终的适宜培养条件。

表1 正交实验的因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

2 结果与分析

2.1 产菊粉酶菌株的筛选

经菌株初筛，共筛选出可利用菊粉的菌株112株，其中真菌41株，细菌71株，表2列出了酶活最高的10株菌的测定结果，可以看出虽然细菌在数量上占有优势，但是真菌的酶活普遍高于细菌，其中真菌A－6的酶活最高为5.30U/mL，因此本研究选取真菌A－6为后续实验菌株。

2.2 菌株鉴定

菌落形态特征:如图1所示，A－6菌在PDA培养基上28℃培养5d，菌落半径达到3.6～4.7cm，边缘整齐呈圆形，丝绒状并产生蓝绿色的孢子。

分子鉴定:A－6菌株 PCR产物测序结果与GeneBank中已知菌株序列比对，结果显示该菌与烟曲霉属的同源性均在98%以上。运用ITS序列构建最大简约树，结果如图2所示，分支处的数值为支持强度，A－6与Aspergillus fumigatus(gi226973986)聚成一支，在所有比对结果中，A－6与Aspergillus fumigatus(gi226973986)的同源序列相似率最高，故鉴定该菌为烟曲霉属(Aspergillus fumigatus.)。

2.3 单因素实验

从图3可以看出，以菊芋提取液为碳源时，菌株的酶活可达到4.02U/mL，明显高于其他碳源，而且比高聚合度的纯菊粉为碳源时产酶活性高。菊芋提取液中有少量的低聚合度的果糖，可能是Aspergillus fumigatus A－6的产酶诱导物。

表2 部分菌株的酶活Table 2 Inulinase activity of 10 strains

图1 菌株A－6的单菌落形态Fig.1 Shape of individual bacterial colony of strain A－6

图2 菌株A－6的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of strain A－6

图3 不同碳源对菌株产酶的影响Fig.3 The effect of different carbon sources on enzyme production

由图4可以看出，有机氮源中，酵母膏作为氮源时，菌株的酶活最高为6.84U/mL，要高于其他的氮源。无机氮源对菌株产酶影响差异不大，采用NH4H2PO4作为氮源时，菌株酶活最高为2.87U/mL，因其中含有P元素，既可以做氮源又可以做磷源，所以用NH4H2PO4为氮源时Aspergillus fumigatusA－6的酶活要高于其他无机氮源。

如图5可以看出，采用KCl和NaCl时菌株酶活均为6.32U/mL，Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+对于菌株的酶活起促进作用，相反的 Ca2+和 Cu2+则对Aspergillus fumigatusA－6酶活有着相对的遏制作用。

从图6可以看出，菌株Aspergillus fumigatusA－6的pH耐受范围较广，在pH为3时仍能表现出一定的酶活，其最适pH为5，此时的酶活最高可达到7.7U/mL，随着pH的升高其酶活逐渐降低，pH为9时酶活仍为3.83U/mL。

图4 不同氮源对菌株产酶的影响Fig.4 The effect of different nitrogen sources on enzyme production

图5 不同无机盐对菌株产酶的影响Fig.5 The effect of different inorganic salt on the production of inulinases

图6 不同pH对菌株产酶的影响Fig.6 The effect of pH on enzyme production

2.4 正交实验

正交实验结果由表3和表4可以看出，各个因素对菌株酶活的影响大小顺序依次为:菊芋提取液(EJA)＞pH＞酵母膏(YE)＞NaCl，根据各个组合酶活力确定出最优组合是A3B4C2D1;但是根据K值，A因素的最佳条件为A4，此时的最优组合为A4B4C2D1，此组合未出现在正交实验中，需要进行实验验证，以比较两个组合的效果，确定最优产酶条件。

按正交实验所得的两组产酶组合，对Aspergillus fumigatusA－6同时进行3批次的产酶培养，测得酶活结果见表5，可看出最佳产酶组合为A3B4C2D1，该组合培养基组分为菊芋提取液(EJA)100g/L，酵母膏(YE)25g/L，NaCl为5g/L，NH4H2PO45g/L，pH为5，此时菌株的酶活的平均值为13.27U/mL，实验结果具有较好的稳定性。

表3 正交实验结果Table 3 Results and analysis of orthogonal design

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

表5 正交实验验证Table 5 Verification of orthogonal design

3 结论

本研究自菊芋盐碱地种植土壤中筛选得到112株产菊粉酶菌株，并从中得到酶活较高的真菌A－6，分子鉴定结果显示该菌为烟曲霉Aspergillus fumigatus，烟曲霉产菊粉酶的研究国内报道较少，此研究丰富了产菊粉酶菌株的种类。对产酶条件的单因素实验显示碳源菊芋提取物，有机氮源酵母膏和无机氮源NH4H2PO4对于菌株酶活的影响较大，真菌A－6的pH适应范围较广，为pH5～9。综合正交实验的分析结果，真菌A－6的最佳发酵产酶培养条件为菊芋提取液(EJA)100g/L，酵母膏(YE)25g/L，NaCl为5g/L，NH4H2PO45g/L，pH为5，30℃，170r/min下振荡培养3d，此时酶活测定结果为13.29U/mL，与单因素实验时的酶活相比，提高了72%。另外，验证实验显示，正交实验所得的最佳培养条件下，菌株的酶活相对稳定。可以看出通过正交优化，真菌A－6的酶活可得到显著提高，并且该菌的pH适应范围较宽，具有菌株改良以进一步提高酶活的潜力，本研究丰富了产菊粉酶菌株的品种资源，为产菊粉酶基因的后续克隆与转化，乃至工业化应用研究提供了理论和实验基础。

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Screening of inulinase production strain and optimization of fermentation condition

HUANG Yu－ling1，WANG Gui－feng2，LONG Xiao－hua1，*，LIU Zhao－pu1，WANG Lin1，WANG Bo1
(1.Key Laboratory of Marine Biology of Jiangsu Province，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China; 2.Shandong Province Agricultural Science and Technology Development Center，Ji’nan 250014，China)

112 strains producing inulinase were isolated from rhizosphere soil of Jerusalem artichoke in the saltaffected land.Strain A－6 was obtained and identified asAspergillus fumigatusthrough observing its shape of individual bacterial colony and amplified the rRNA gene sequence using fungal universal primers ITS1 and ITS4.The effect of different factors on its enzyme production shown A－6 had a wide pH range and it could tolerate the high concentration of NaCl.After analysis of orthogonal design，the optimum condition for higher inulinase production of A－6 was determined:EJA 100g/L，YE 25g/L，NaCl 5g/L，NH4H2PO45g/L，pH5，3d of growth under 30℃ and 170r/min in shake cultures.Maximal inulinase activity of A－6 was 13.29U/mL.

screening;inulinase;Aspergillus fumigatus;fermentation condition;optimizing

TS201.3

A

1002－0306(2012)21－0160－04

2012－03－13 *通讯联系人

黄玉玲(1986－)，女，硕士，研究方向:菊粉酶菌株与菊芋发酵。

国家科技支撑项目(2011BAD13B09);江苏省科技支撑项目(BE2010305和BE2011368);公益性行业(农业)科研专项经费项目(200903001－05);中央高校基本业务费项目(Y0201100249);教育部博士点基金(20100097120016)。