罗艳霞，黄明志，郭元昕，王泽建，储 炬

(华东理工大学生物反应器国家重点实验室，国家生化工程技术研究中心，上海 200237)

活细胞传感仪在嗜酸乳酸杆菌培养过程中的应用

罗艳霞，黄明志*，郭元昕，王泽建，储 炬

(华东理工大学生物反应器国家重点实验室，国家生化工程技术研究中心，上海 200237)

活细胞是嗜酸乳酸杆菌发酵过程的目标产物，但长期以来一直缺乏一种能快速、准确地检测发酵液中活细胞量的方法，本文引入了一种基于电容原理的活细胞量测量新方法，探讨了其在嗜酸乳杆菌培养过程中在线应用的可行性。研究结果表明，活细胞传感仪测定的活细胞数与平板活菌计数法测定的菌体浓度有非常好的线性关系，相关系数达0.9944，在相同的实验条件下，仪器测定数据具有较好的重复性，基于电容值计算出的比生长速率比基于CER、OUR计算出的比生长速率更可信。因此活细胞传感仪为嗜酸乳杆菌培养过程在线监测提供了一种简便、精确的方法。

活细胞传感器，电容，嗜酸乳杆菌

发酵过程最本质的特征在于通过细胞代谢活动来实现目标产物的生产，大量具有代谢活性的细胞及适宜的培养环境是发酵过程得以高效进行的前提条件。在发酵过程的检测和控制参数中，温度、溶氧(DO)、pH等参数描述了细胞所处的培养环境，而细胞量直接反映了细胞的数量，对发酵过程有着更为重要的影响。目前细胞量的测定方法可分为离线和在线两大类。常见的离线测定法有:菌体干重(DCW)、吸光度、离心体积(PMV)和平板计数等。但这些离线方法费时费力，容易受实验条件者等外界因素影响，测定的细胞量仅能大致反映菌体生长趋势，不易发现发酵过程中关键时刻活菌体浓度的变化。因此，近些年国内外提出了多种活细胞浓度在线测定仪器，主要有原位显微镜法［1］、近红外光谱法［2］、激光散射分析法［3］、荧光分析法［4］、电容法和电阻法［4］等。其中电容法测量受细胞组成形式、气泡及不溶性物质等因素的影响比较小，已成功被应用于多个生物过程中，如酵母菌［5－7］、链霉菌［8］、CHO［9］、枯草芽孢杆菌［10］和干酪乳杆菌［11］等。嗜酸乳杆菌是一种益生菌，被广泛用于食品和医药领域，是一种活菌制剂，对其质量除了要符合食品和药品的一般要求外，从生产到储存保质期内的每个环节，都是以最大限度的保存活菌数为目标［12］。嗜酸乳杆菌培养过程中细胞生长快速、生产周期短，而目前常用的平板计数法耗时较长，测量结果出来时培养过程往往已经结束，难以应用到工艺控制和优化上，因此研究出一种能在线监测培养过程中细胞量的方法，对提高生产效率和产品质量显得非常重要。本论文将电容法活细胞传感仪应用到嗜酸乳酸杆菌补料分批高密度培养过程中，并与其它常见细胞量测定法比较，对这种方法的重复性和其它在线表现菌活力的方法相关性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胰蛋白胨 MERCK公司;酵母粉 OXOID公司;葡萄糖 华北制药康欣有限公司;番茄 当地市场;MRS OXOID公司;嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilusYIJ2004) 上海信谊药厂有限公司提供。

JJ1000型精密电子天平 美国双杰兄弟有限公司常熟双杰测试仪器厂;FA004型电子天平 上海爱平仪器有限公司;洁净工作台 上海汇龙仪表电子有限公司;TDL－80－2B型低速离心机 南京以马内利仪器厂;TGL－16B型高速离心机 上海安亭科学仪器厂;电热恒温鼓风干燥箱 上海华连医疗器械有限公司;721S型可见分光光度计 上海棱光技术有限公司;活细胞传感仪BIOMASS MONITOR 220型 英国ABER公司;GX－2生物量浓度在线检测仪 南宁安胜达科技有限公司;过程气体质普分析仪MAX300－LG Eextrel，USA;15L发酵罐FUS－15L

上海国强生化工程装备有限公司;BIORADAR软件包 国家生化工程技术研究中心，生物过程软件“发酵之星”华东理工大学。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基 疱肉管培养基配方为(g/L):蛋白胨30，酵母膏5，葡萄糖3，牛肉浸液1000，可溶性淀粉2，磷酸二氢钠5，碎肉渣适量，pH7.6(用NaOH调);种子培养基配方为(g/L):胰蛋白胨10，酵母粉6，葡萄糖16，磷酸氢二钾2，乙酸钠5，Twen80 1mL，番茄汁200mL，pH7.0(用NaOH调);发酵培养基(g/L):胰蛋白胨16，酵母粉15，葡萄糖2，磷酸氢二钾2，硫酸镁0.1，硫酸亚铁0.01，硫酸锰0.01，乙酸钠 5，Twen80 1mL，番茄汁200mL，pH7.0(用NaOH调)。

1.2.2 番茄汁制备 番茄洗净后打碎，煮沸0.5h左右，用八层纱布过滤。

1.2.3 牛肉渣制备 当地市场购置牛肉，去脂肪绞碎，1kg加2L水，煮沸2h，过滤，滤液制成牛肉浸液，滤渣用清水漂洗，泡24h，滤去水，滤渣80℃烘干备用。

1.2.4 疱肉管制备 按1.2.1配方配制疱肉管培养基，用NaOH调pH7.6，吸取7mL液体装入有15× 150刻度的玻璃试管，用棉塞塞好后包扎，121℃灭菌15min。

1.2.5 培养条件 疱肉管培养条件:挑单菌落接入按1.2.4制好的疱肉管中，37℃静置培养18～24h;种子培养条件:按1.2.1配方，配800mL种液，分装两个500mL摇瓶，121℃灭菌20min，冷却后，吸取疱肉管种子液5mL接入种子瓶中，37℃静置培养14h;发酵培养条件:15L发酵罐装液量8L，接种量10%，温度30℃，通气量1～3L/min，培养时间14h。pH通过自动流加25%NaOH溶液进行调节，葡萄糖通过流加500g/L的葡萄糖控制2～5g/L。

1.3 测定方法

1.3.1 干重测量 取10mL发酵液装入10mL离心管中，8000r/min离心10min，再用去离子水清洗2次，直至洗掉发酵液中的残糖，然后将试管连同固体一起放到80℃烘箱中烘至恒重。

1.3.2 OD600测量 取一定量发酵液，8000r/min离心10min，取得上清液稀释发酵液至适当倍数后，在波长600nm下测量吸光值。

1.3.3 平板活菌计数(cfu/mL) 发酵液稀释至适当倍数后，涂MRS平板，37℃培养48h后计数。

1.3.4 还原糖测定 DNS法［13］。

1.3.5 活细胞数分析 采用Biomass Monitor 220检测发酵过程中活细胞浓度。电容法在线活细胞传感仪测定活细胞数的原理可参见其它文献［14］。电容(Cap)和电导率单位分别用pF/cm和mS/cm表示，可通过将该仪器电极插到15L发酵罐中，121℃灭菌消毒后在线测得。Biomass Monitor 220仪器可采用多频测量，频率范围0.1～10MHz，通过高低频率下分别测得的发酵液电容值，便可计算出发酵液电容值，电导范围1～100mS/cm，几乎涵盖了所有发酵的电导率范围。

1.3.6 细胞量在线分析 采用GX－2生物量浓度在线检测仪，利用光密度法(OD)原理，测得的OD值与总细胞量成正比。

1.3.7 气体成分分析 发酵过程中排出气体的O2和CO2含量分别用过程气体质谱分析仪MAX300－LG测定，通过生物过程软件“发酵之星”进行处理，在线计算二氧化碳生成速率CER、氧气消耗速率OUR等间接参数。

1.3.8 在线参数处理 发酵罐用BIORADAR软件包控制，提供直接参数(如:O2、CO2等)与间接参数(比如氧气消耗速率(OUR)、二氧化碳生成速率(CER)、呼吸商(RQ)等)的在线检测与控制(图略)。

2 结果与分析

2.1 分析条件优化

因为发酵培养基没有不溶物，根据仪器说明书，确定为单频模式。细菌低通滤波值范围一般在30～60之间，本文考察了低通滤波值为30、40、50条件下电容基线和噪音大小，发现LPF为40时基线噪声小。取对数期发酵液，离线条件下进行全频扫描，确定使用频率为1200kZ。

为了确定嗜酸乳杆菌分批补料高密度培养过程中电容值信号确实是对菌体的响应，在发酵结束后后，将发酵液8000r/min，离心10min，弃菌体，再用活细胞传感仪测定上清液，离心前后电容值和电导率的变化见图1。

由图1可以看出，离心后，上清液电容值由1.75pF/cm降低至接近为零，而电导率基本不变，为28.6mS/cm左右。由此可见，嗜酸乳杆菌分批补料过程中，用Biomass Monitor 220测定发酵液电容值反映了活菌数的变化。

2.2 电容值与活细胞量之间对应关系

按1.2.5条件发酵，在属于细胞对数生长期内的4～11h内分别取样按1.3.1法离线测定细胞干重，结果见表1。

表2 电容法测定电容值(Cap)与CFU、DCW、OD600nm及在线OD法测定的菌体浓度间线性关系方程Table 2 Linear relationship between capacitance(Cap)and biomass concentration estimated by CFU，DCW，OD600nmor OD method

图1 发酵液离心前后电容和电导率变化Fig.1 Changes of capacitance and conductivity in fermentation liquid before and after the centrifugation

表1 对数期菌体干重与电容的关系Table 1 The relationship of DCW and Cap in Logarithmic phase

将离线测定的菌体干重与在线测定的电容值进行线性回归，得到式(1):

DCW=2.5915×Cap－0.4607 式(1)

其相关系数为0.9934，可见在研究的范围内，活细胞传感仪测量出的电容值能准确地反映活细胞量变化。

2.3 电容法与其它常见的测定方法的比较

将电容法在线测定的菌体浓度与其它常见的菌体浓度离线测定法(比如OD600nm、干重、平板活菌计数)和在线光密度法(在线OD)进行比较，结果见图2。

图2 在线电容法与离线干重、OD600nm、CFU及在线光密度法测定菌体浓度比较Fig.2 Comparison of biomasses estimated by on－line capacitance measurement and off－line biomass determination of dry cell weight，cell optical density at 600nm wavelength，number of colony forming units or on－line optical density

由图2可以看出，在线电容法测定菌体浓度(Cap)与其它离线和在线测定菌体浓度法都能描述菌体生长的大致趋势，但当开始进入稳定期(10h后)，DCW、OD600nm及在线 OD与 CFU、Cap偏离，DCW、OD600nm及在线OD在持续上升，而CFU、Cap经过短暂上升后有所下降，这是由于进入稳定期后，菌体生成缓慢，总活菌数变化不大，但总菌体量还在增长。

细胞电容值(Cap)与各离线法和在线光密度法测定菌浓线性关系见表2。

由表2看出Cap与CFU具有很好的线性相关，相关系数达到0.994。因此活细胞传感仪可用于在线监测嗜酸乳杆菌培养过程中活细胞数，了解细胞生长代谢状况、指示放罐时机是一种简便可行的方法。

2.4 数据重复性考察

按1.2.2的方法，在相同的培养条件下，重复三批实验，对测定电容值进行分析，结果见表3。

表3 相同发酵条件下，三批干重与电容值线性相关方程Table 3 Linear relationship between Capand DCW measurements in three fermentations using the same growth conditions

由此可以看出干重和电容值线性相关重复性很好，平均线性相关方程见式(2)。因此在线活细胞传感仪，是一种非常可信的方法。

2.5 比生长速率在线估计

电容法在线活细胞传感仪测定发酵液的电容值与活细胞数成正比，可用于在线计算比生长速率［15］。基于电容法计算出的比生长速率(μ)可通过式(3)计算。

式(3)中常数a为菌体浓度与电容之间的系数，可离线测定。在不同的生物过程中OUR、CER和菌量存在一定的关系［16］，OUR(CER)=XQ，假设活细胞的呼吸强度Q是一样的，那么OUR、CER和活细胞量之间也存在正比关系。比生长速率可分别用式(4)和式(5)计算。

发酵过程中，基于电容、CER、和OUR进行估计的比生长速率变化如图3所示。

图3 电容法、OUR和CER估计的比生长速率Fig.3 The specific growth rate estimate by Cap，OUR or CER

从图3可以看出发酵过程中比生长速率(μ)不断波动，基于CER、OUR计算的比生长速率比基于电容估算的比生长速率波动较大。是由于活细胞传感仪测定的活细胞数仅受菌体浓度和菌体大小影响，而受培养环境如气泡、不溶物等外界环境因素影响较小，而虽然过程质谱仪分析的精度也很高，但菌体培养过程中，菌体的呼吸强度受补料、浓氧、pH等外界条件的变化影响比较大。所以基于电容估算的比生长速率更可信，可为以后嗜酸乳杆菌培养过程提供更可靠和精确的控制策略。

2.5 结合活细胞量在线测定的嗜酸乳杆菌培养过程参数相关分析

图4是按1.2.2条件进行发酵实验，嗜酸乳杆菌补料分批发酵过程参数变化曲线图。

图4 嗜酸乳杆菌补料分批发酵过程各参数变化曲线Fig.4 Time course of Fed－batch fermentation of Lactobacillus acidophilus

由图4可以看出，发酵开始经过3h左右的生长适应期后，开始进入对数生长期，菌体快速生长，活细胞量浓度迅速增加，耗糖量、消耗葡萄糖产生的二氧化碳量和二氧化碳释放速率都同步快速增加。到5h左右，活细胞量有一段缓慢生长期，二氧化碳生成量和二氧化碳释放速率突然降低，这是由于碳源不足，限制了菌体生长，因此从这时开始补加葡萄糖，进行补料分批发酵培养。活细胞量浓度继续增加，电容值继续升高，从12h左右开始，菌体生长进入了稳定期，电容值维持不变，因为活细胞量浓度缓慢增加后基本维持不变，二氧化碳生成量和二氧化碳释放速率快速下降，碳源充足。由此可见，电容值更好地描述了整个发酵过程中活细胞量的变化情况，这为嗜酸乳杆菌培养工艺的控制和优化提供了良好的条件。

3 结论

本文探讨了在嗜酸乳杆菌这培养过程中应用电容原理的活细胞传感仪在线监测活细胞量的可行性。研究结果表明，电容法测定活细胞数与平板活菌计数测定菌体浓度法有很好的线性对应关系，且相同的实验条件下，仪器测定结果重复性比较好。在比生长速率的估算中，基于电容法估算出的比生长速率比基于CER、OUR估算出的比生长速率更可信。综上所述，活细胞传感仪可用于在线检测嗜酸乳杆菌分批补料高密度培养过程中活细胞数，从而使我们能更好地了解菌体生长代谢状况、指示放罐时机等，为以后嗜酸乳杆菌培养过程提供了一个方便可信的在线监测手段。

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The application of viable cell mass monitoring inLactobacillus acidophiluscultivation

LUO Yan－xia，HUANG Ming－zhi*，GUO Yuan－xin，WANG Ze－jian，CHU Ju
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China)

Viable cell is the final products ofLactobacillus acidophilusfermentation process.However，at present，there is no efficient method to monitor it on－line quickly and accurately.In this paper，a new method that based on the capacitive principle for on－line monitoring viable－cell mass was employed.As a result，the relationship between the number of colony forming units(CFU)and capacitance with a correlation coefficient(R)of 0.9944 was achieved and data showed a good reproducibility under the same culture conditions.Simultaneously，compared with those determined by indirect online estimation methods including oxygen uptake rate(OUR)and carbon dioxide evolution rate(CER)，the specific growth rate estimated by on－line capacitance measurement could be more reliable duringLactobacillus acidophilusfermentation process.Therefore，it could be concluded that a capacitance probe was a simple as well as a accurate tool inLactobacillus acidophiluscultivation process.

viable－cell mass monitoring;capacitance;Lactobacillus acidophilus

TS201.3

A

1002－0306(2012)21－0152－05

2012－03－27 *通讯联系人

罗艳霞(1985－)，女，硕士，研究方向:益生菌培养工艺过程优化与放大。

十二五“科技支撑计划”(2011BAF02B03);国家高技术研究与发展计划(863计划)(2012AA021201);十二五“973”项目(2012CB721006)。