于 玮，赵瑞英，赵 琰，唐元元，施用晖，2，乐国伟，2，*

(1.江南大学食品学院食品营养与功能因子研究中心，江苏无锡 214122;

2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122)

蛋氨酸羟基类似物对肉鸡肠道氧化还原状态的影响

于 玮1，赵瑞英1，赵 琰1，唐元元1，施用晖1，2，乐国伟1，2，*

(1.江南大学食品学院食品营养与功能因子研究中心，江苏无锡 214122;

2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122)

目的:研究蛋氨酸(DLM)、蛋氨酸羟基类似物(HMTBA)及其钙盐(HMTBA－Ca)对肉鸡肠道氧化还原状态的影响。方法:1日龄罗斯肉鸡(44g)随机分为对照组(基础日粮)和实验组(在基础日粮中分别添加0.1%和0.2%的DLM、HMTBA及HMTBA－Ca)，共7个处理组。结果:与对照组相比，0.1%HMTBA组和0.1%HMTBA－Ca组可显著降低全血ROS水平，提高肠道GSH/GSSG和T－AOC，降低血浆及组织MDA含量。0.2%HMTBA组和0.2%HMTBA－Ca组可显著提高血浆和组织CAT活性。基础日粮中添加HMTBA和HMTBA－Ca均可使肠绒毛高度升高、隐窝深度下降、V/C升高。此外，0.1%HMTBA组和0.1%HMTBA－Ca组ROS水平及MDA含量均低于0.1%DLM组，肠绒毛高度和V/C则高于0.1%DLM组。结论:与DLM相比，HMTBA及HMTBA－Ca能更好地提高肠道抗氧化能力，降低ROS水平，维持肠道氧化还原稳态，促进肠道健康发育。

蛋氨酸，蛋氨酸羟基类似物，氧化还原状态，肠道形态结构

家禽体温高，代谢强度大，是研究机体氧化还原状态的理想模型。肠道是动物体内营养物质消化吸收的主要场所，也是自由基(ROS)产生的主要场所。过量ROS诱发氧化应激，极易损伤肠道粘膜等，导致消化吸收功能异常和肠源性感染，影响肠道粘膜细胞的增殖与分化［1］。因此，维护肠道氧化还原稳态对维持生长发育与健康具有重要意义。蛋氨酸是机体必需氨基酸之一，在体内发挥重要生理功能［2－3］。目前，常用蛋氨酸源包括DL－蛋氨酸(DLM)、蛋氨酸羟基类似物(HMTBA)及其钙盐(HMTBA－Ca)。日粮中添加DLM过量极易引起脂质过氧化损伤［4］和血管内膜损伤［5］等毒性作用，而添加过量等摩尔DLM和HMTBA，HMTBA组血浆中同型半胱氨酸(Hcy)水平显著低于DLM组［6］，Hcy可引起肝脏氧化应激、抗氧化能力下降［7］，推测DLM的毒性可能与氧化损伤有关。HMTBA是蛋氨酸α－碳上氨基被羟基取代的产物，与DLM相比，HMTBA可缓解动物热应激［8］、减少氮排泄［9］和清除自由基［10］等作用。HMTBA作为一种蛋氨酸源具有抗氧化活性高和毒性低的特点。目前，对HMTBA的研究主要集中在生物学相对效价和体内代谢转化，而有关HMTBA及其钙盐调节氧化还原状态的研究，国内未见相关报道。因此，本实验以罗斯肉鸡作为研究对象，通过日粮中添加不同剂量蛋氨酸源(DLM，HMTBA和HMTBA－Ca)，研究其对肉鸡肠道氧化还原状态及形态结构的影响，为进一步研究氧化还原状态对肠道功能的影响提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1日龄健康雄性罗斯肉鸡(体重约44g) 江苏无锡祖代鸡场有限公司;DL－蛋氨酸(DLM，纯度98%)、蛋氨酸羟基类似物(HMTBA，纯度88%)、蛋氨酸羟基类似物钙盐(HMTBA－Ca，纯度84%)

ADISEEO公司。

5430R低温高速离心机 德国Eppendorf公司; MPI－B型多参数化学发光检测仪 西安瑞迈分析仪器公司;F96荧光分光光度计 上海棱光技术有限公司;WH－3微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器有限公司;DK－600型电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司;Mk3酶标仪 美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组与饲养 1日龄雄性罗斯肉鸡105只，随机分为:对照组和实验组(0.1%DLM组、0.2%DLM组、0.1%HMTBA组、0.2%HMTBA组、0.1%HMTBA－Ca组及0.2%HMTBA－Ca组)。对照组饲喂基础日粮，实验组饲喂基础日粮分别添加0.1%DLM、0.2%DLM、0.1%HMTBA、0.2%HMTBA、0.1%HMTBA－Ca、0.2%HMTBA－Ca。每组3个重复(笼)，每个重复5只鸡。

肉鸡基础日粮参照《家禽营养需要》(NRC，1994)，基础日粮组成见表1。前期和饲料均制成颗粒。

实验期46d，采用笼养，24h光照，自由采食与饮水。1～21日龄饲喂前期颗粒料，22～46日龄饲喂中期颗粒料。按常规方法进行免疫接种。

1.2.2 样品制备 在实验的第46d采集样品(每个重复取2～3只，每组共取8只)。肉鸡称重后断颈取血处死，全血肝素钠抗凝立即测自由基(ROS)，其余离心(4000r/min，10min)制备血浆。取肝脏、十二指肠、空肠、回肠和盲肠肠段，用预冷生理盐水按1∶10 (W/V)制备组织匀浆液，测定氧化还原指标。分别剪下十二指肠(离胃幽门3cm处)和空肠中段组织约1cm，置于4%甲醛溶液固定。

表1 基础日粮组成(%)Table 1 Compositions of basal diet(%)

1.2.3 自由基检测 参照luminol化学发光法测定全血中自由基(ROS)水平。取新鲜抗凝血25μL稀释于855μL Hepes(pH7.4)缓冲液中，加入20μL HRP (12.4U/mL)作为催化剂，将反应体系混匀，使用MPI－B型多参数化学发光检测仪进行检测，启动发光后注射100μL luminol(5mmol/mL)于整个反应体系中［10］。以发光强度表示ROS水平的高低。

1.2.4 氧化还原指标的测定 血浆和组织的氧化还原指标:还原型与氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/ GSSG)、过氧化氢酶 (CAT)、总抗氧化能力(T－AOC)、和丙二醛(MDA)，采用试剂盒测定，并严格按照说明书进行。

1.2.5 石蜡切片的制作与观察 4%甲醛溶液固定的肠道组织依次经脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→展开→贴片等处理，苏木精－伊红染色制成组织切片［11］，显微镜观察并测量各肠段的绒毛高度(V)及相应的隐窝深度(C)，并计算V/C。

1.3 数据处理与统计方法

2 结果与分析

2.1 不同蛋氨酸源对肉鸡血浆和肝脏自由基(ROS)的影响

由表2显示，基础日粮中添加0.1%HMTBA和0.1%HMTBA－Ca可显著降低全血 ROS水平(p＜0.05)。而0.1%DLM组和0.2%DLM组ROS水平与对照组相比无显著性差异。表明HMTBA和HMTBA－Ca体内抗氧化活性明显优于DLM。

表2 不同蛋氨酸源对肉鸡全血自由基水平的影响(全血:cd/μL)Table 2 Effects of methionine sources on ROS contents of blood of broiler chickens(blood:cd/μL)

表3 不同蛋氨酸源对肉鸡血浆和组织GSH/GSSG的影响(比值)Table 3 Effects of methionine sources on GSH/GSSG of plasma and tissues of broiler chickens(ratio)

表4 不同蛋氨酸源对肉鸡血浆和组织CAT的影响(血浆:U/mL;组织:U/mg prot)Table 4 Effects of methionine sources on CAT contents of plasma and tissues of broiler chickens(plasma:U/mL;tissues:U/mg prot)

表5 不同蛋氨酸源对肉鸡血浆和组织T－AOC的影响(血浆:U/mL;组织:U/mg prot)Table 5 Effects of methionine sources on T－AOC contents of plasma and tissues of broiler chickens(plasma:U/mL;tissues:U/mg prot)

2.2 不同蛋氨酸源对肉鸡血浆和组织GSH/GSSG的影响

谷胱甘肽是体内重要的小分子活性寡肽，包括还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，在生物体内防御体系中起重要作用［12］。GSH能够清除自由基而自身转化为GSSG［13］。机体在正常状态下，GSH/GSSG处于稳定状态;当机体受到氧化协迫时，产生大量ROS，导致GSH减少，GSSG含量提高［14］。因此GSH/GSSG是反映氧化还原状态的重要指标。由表3可知，在基础日粮中添加3种蛋氨酸源均可不同程度提高血浆和组织GSH/GSSG。其中HMTBA组的血浆、肝脏、空肠、回肠、盲肠以及HMTBA－Ca组的血浆、十二指肠、肝脏、回肠、盲肠的GSH/GSSG比值高于DLM组。

2.3 不同蛋氨酸源对肉鸡血浆和组织CAT的影响

CAT可清除过氧化体系中的H2O2，是衡量ROS生成量的重要指标［15］。与对照组相比，表4显示，0.2%HMTBA组和0.2%HMTBA－Ca组血浆、肝脏、盲肠CAT活性显著提高(p＜0.05)，0.2%HMTBA－Ca组回肠活性显著提高(p＜0.05)。且0.2%HMTBA和0.2%HMTBA－Ca组CAT活性高于0.1%HMTBA和0.1%HMTBA－Ca组。与之相反，0.1%DLM组十二指肠、空肠的CAT活性显著降低(p＜0.05)。

2.4 不同蛋氨酸源对肉鸡血浆和组织T-AOC的影响

T－AOC反映机体防御体系总抗氧化能力的强弱，与健康程度存在着密切联系。由表5可知，3种蛋氨酸源均可显著提高肉鸡回肠、盲肠T－AOC水平(p＜0.05)。与对照组相比，0.1%HMTBA组、0.2% HMTBA组和0.1%HMTBA－Ca组可显著提高回肠、盲肠的T－AOC水平(p＜0.05)。0.1%HMTBA组的十二指肠、空肠和0.2%HMTBA组的血浆、肝脏以及0.1%HMTBA－Ca组的空肠、0.2%HMTBA－Ca组的盲肠与对照组相比T－AOC水平显著提高(p＜0.05)。而DLM组的血浆、肝脏、空肠与对照组相比则无显著性差异。

2.5 不同蛋氨酸源对肉鸡血浆和组织MDA的影响

MDA是脂质过氧化过程中产生的活性羟基类物质，具有细胞毒性，其含量高低反映机体脂质过氧化水平和细胞损伤的程度。如表6所示，与对照组相比，各实验组肝脏和盲肠MDA含量均显著降低(p＜0.05)。除此之外，与对照组相比，0.1%HMTBA组的空肠及回肠的 MDA含量均显著降低(p＜0.05)，0.1%HMTBA－Ca组中除血浆、空肠外其他组织的MDA含量均显著降低(p＜0.05)，0.2%HMTBA组和0.2%HMTBA－Ca组中除血浆外其余组织的MDA含量均显著降低(p＜0.05)。与DLM组相比，HMTBA组及HMTBA－Ca组能够更显著地降低组织的MDA含量。

表6 不同蛋氨酸源对肉鸡血浆和组织MDA的影响(血浆:nmol/mL;组织:nmol/mg prot)Table 6 Effects of methionine sources on MDA contents of plasma and tissues of broiler chickens(plasma:nmol/mL;tissues:nmol/mg prot)

表7 不同蛋氨酸源对肉鸡肠组织形态结构的影响(绒毛高度:μm;隐窝深度:μm)Table 7 Effects of methionine sources on intestinal villus height and recess depth of broiler chickens(villus height:μm;recess depth:μm)

2.6 不同蛋氨酸源对肉鸡肠道组织形态结构的影响

由表7可知，与对照组相比，各实验组的十二指肠及空肠绒毛高度均有一定程度提高。除0.2%DLM组和0.2%HMTBA组外，其余各组十二指肠绒毛高度均显著提高(p＜0.05)。各实验组隐窝深度显著降低，以0.1%HMTBA－Ca组差异最为显著(p＜0.05)。此外，基础日粮中添加0.1%HMTBA－Ca可显著提高V/C比值，表明HMTBA－Ca可调节十二指肠和空肠发育。

3 讨论

肠道是机体营养物质消化吸收的主要场所，物质代谢和能量代谢极其旺盛，分泌腺体与粘膜细胞极易受氧化应激损伤，肠道结构与功能的完整性与氧化还原稳态密切相关［16］。高温、高能膳食等环境和营养因素极易引发氧化应激。当机体处于氧化应激状态时，ROS可直接造成肠道脂质过氧化损伤、蛋白质变性以及酶失活，进而导致肠粘膜损伤、粘液层变薄、绒毛变短、绒毛表面积减少等生理破坏，严重影响肠道吸收消化功能［1，17－18］。因此，维护肠道氧化还原稳态对动物生长发育具有重要意义。研究发现，高脂膳食引发肠道氧化还原状态失衡，硫辛酸通过直接清除自由基以及提高抗氧化通路相关功能基因的表达水平解除氧化应激，防止由高脂膳食引发的肠道功能损伤［19］。日粮中添加适量抗氧化剂(如VC、VE、硫辛酸、铁硒锌、半胱胺等)可提高肠道抗氧化能力，维护氧化还原健康稳态［1，16］。

HMTBA及其钙盐是一种廉价且可靠的蛋氨酸源。研究发现，HMTBA与DLM的结构差异使其发挥不同生理作用。由于HMTBA及其钙盐本身不含有氨基，因而在代谢中不会发生脱氨基作用，在体内代谢形成蛋氨酸的过程中可有效利用血液游离氨，增加氮沉积，减少氮排泄［9］。与DLM相比，HMTBA转化成尿酸时产生较少的余热，可有效缓解热应激［8］。杨永兰等［10］报道，高脂日粮中添加一定剂量的HMTBA可显著降低小鼠血液和肝脏ROS和MDA水平，提高T－AOC和CAT活性。可见，HMTBA不仅是一种蛋氨酸源同时还具有抗氧化活性。蛋氨酸是禽类第一限制性氨基酸，本实验以罗斯肉鸡作为研究对象，通过在基础日粮中添加不同剂量蛋氨酸源，探讨其对肠道氧化还原状态的影响。结果显示，HMTBA及其钙盐可显著降低肉鸡全血的ROS水平，提高血浆及肠道GSH/GSSG、CAT活性、T－AOC能力，显著降低血浆及肠道MDA水平，且效果优于DLM。表明HMTBA及其钙盐维持肠道氧化还原稳态与其抗氧化活性有关。本实验室前期研究发现，体外HMTBA对·OH以及DPPH·的清除能力和肝脏脂质过氧化抑制率显著高于DLM。等摩尔DLM和HMTBA饲喂北京鸭，DLM组的血浆同型半胱氨酸(Hcy)含量显著高于HMTBA组［6］，可引起肝脏氧化应激和脂质过氧化物含量升高［7］。Martin－Venegas等［20］报道，HMTBA在肠道比DLM能更有效地生成半胱氨酸(Cys)和牛磺酸(Tau)，前者作为谷胱甘肽的前体在肠道上皮细胞的抗氧化功能中发挥关键作用，牛磺酸具有解毒、抗氧化等多种生理功能。此外，与DLM在肠道的主动吸收［21］不同，HMTBA主要通过被动扩散［22］进入机体，并经由代谢转换为蛋氨酸发挥生物学功能。主动转运需要消耗ATP易产生大量ROS，而被动扩散不消耗ATP产生的ROS较少。可见，HMTBA及其钙盐在体内发挥抗氧化作用，其可能是通过直接或代谢转换清除ROS的。

肠道绒毛高度与细胞数呈显著相关，只有成熟细胞才具有吸收养分的功能，绒毛越长，成熟细胞多，养分吸收能力好;隐窝深度反映细胞生成率，隐窝变浅，表明细胞成熟率上升，分泌功能增强［23］。绒毛高度/隐窝深度则综合反映肠道功能状态，比值下降，表明粘膜受损消化率下降;比值上升，则粘膜改善，吸收功能增强，生长加快［23］。本研究发现基础日粮中添加HMTBA和HMTBA－Ca可显著提高十二指肠、空肠的绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度，降低相应的隐窝深度。表明蛋氨酸羟基类似物及钙盐可促进肠细胞发育，改善小肠功能状态，降低肠粘膜受损程度，这可能与HMTBA的抗氧化能力有关。

综上，蛋氨酸羟基类似物及钙盐能提高肠道抗氧化能力，降低ROS水平，维持肠道氧化还原稳态，并且有利于肠道细胞发育，具体的作用机制还有待于进一步研究。

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Effect of 2－hydroxy－4－(methylthio)butanoic acid on intestinal redox state of broiler chickens

YU Wei1，ZHAO Rui－ying1，ZHAO Yan1，TANG Yuan－yuan1，SHI Yong－hui1，2，LE Guo－wei1，2，*
(1.School of Food Science and Technology，The Research Center of Food Nutrition and Functional Factors，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;
2.The State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Objective:To research the effects of methionine sources methionine(DLM)，2－hydroxy－4－(methylthio) butanoic acid(HMTBA)and 2－hydroxy－4－(methylthio)butyrate calcium(HMTBA－Ca)on intestinal redox state of broiler chickens.Method:One hundred and five(105)broiler chickens(44g)were randomly divided into 7 groups (15 birds per group)，and each group was assigned to 1 of 3 treatments.Birds in each group were kept in three coops(5 broilers per coop).All broilers were offered the same basal diet with added DLM，HMTBA and HMTBACa at levels of 0(control group)，0.1%and 0.2%.Results:Compared with control group，basal diet with 0.1% HMTBA group and 0.1%HMTBA－Ca group could decrease the level of free radicals in whole blood significantly，enhance the activity of GSH/GSSG，T－AOC of the serum and tissues significantly，decrease the level of MDA significantly.Compared with control group，basal diet with 0.2%HMTBA group and 0.2%HMTBA－Ca group could enhance the activity of CAT of the serum and tissues significantly.Basal diet with added HMTBA，HMTBA－Ca could enhance the intestinal villus height(V)and the ratio of the villus height to recess depth of broilers(V/C)，decrease the intestinal recess depth(C)of broilers significantly.Compared with 0.1%DLM group，ROS，MDA levels were lower and V，V/C were higher in basal diet with 0.1%HMTBA group and 0.1%HMTBA－Ca group.Conclusion: Compared with DLM，HMTBA and HMTBA－Ca could better increase the intestinal antioxidative capacity，decrease the level of free radicals，steady intestinal redox state，promote the intestinal development healthily.

methionine;2－hydroxy－4－(methylthio)butanoic acid;redox state;intestinal morphology

TS201.6

A

1002－0306(2012)21－0099－05

2012－04－25 *通讯联系人

于玮(1987－)，女，硕士研究生，主要从事营养代谢与调控方面的研究。

十二五国家科技支撑计划(2012BAD33B05)。