卢 静，许琳莉，王振宁，丛 雯，黄国任，卜秀娟，关 爽

(吉林大学军需科技学院食品质量与安全系，吉林长春 130062)

1，3-DCP通过激活线粒体凋亡通路诱导HepG2细胞凋亡

卢 静，许琳莉，王振宁，丛 雯，黄国任，卜秀娟，关 爽*

(吉林大学军需科技学院食品质量与安全系，吉林长春 130062)

本研究以HepG2细胞为模型，考察1，3－二氯丙醇(1，3－DCP)对HepG2细胞凋亡的影响和机制，为1，3－DCP肝毒性机制研究提供实验依据。结果发现，1，3－DCP在160～640μg/mL浓度范围内，作用于HepG2细胞8h，就可以降低细胞活性，诱导细胞凋亡，使细胞线粒体膜电位下降，细胞内ROS的增高，［Ca2+］i增高，并呈剂量依赖性。从而说明，通过线粒体凋亡通路诱导肝细胞凋亡是1，3－DCP的肝毒性机制之一。

1，3－二氯丙醇，肝毒性，线粒体，细胞凋亡

氯丙醇类化合物是目前国际上广为关注的食品污染物之一，1，3－DCP(1，3－二氯丙醇，1，3－dichloro－2－propanol)是除3－MCPD(3－氯－1，2－丙二醇，3－monochloropropane－1，2－diol)外，研究得最多和最常见的食品氯丙醇类污染物［1］。1，3－DCP是食品中的脂质与氯离子在加工、烹饪和贮藏过程中发生反应而形成的［2］，此外，用ECH阴阳离子交换树脂处理水也会产生大量1，3－DCP［1，3］。根据JEFCA的统计，1，3－DCP的世界平均饮食暴露量为0.008～0.090μg/ kg－bw/day，其中肉及肉制品占54%～72%［2］。由于1，3－DCP在工业生产(环氧树脂、人造橡胶、表面活性剂、染料、制药、造纸等工业)中被大量地使用，因此其在水体等环境中也有大量残留［4］。国际癌症研究机构(IARC)将1，3－DCP列为2B类人类可能致癌物。1，3－DCP可被细胞色素P450酶氧化，具有遗传毒性、致癌性、致畸性、生殖毒性、肝毒性、肾毒性、内分泌毒性、血细胞毒性和皮肤黏膜毒性，其中肝毒性

是其最主要的毒作用［2，3，5－10］，其肝毒作用机制源于代谢酶抑制、脂质过氧化和谷胱甘肽耗竭等［3，6，9，11］。研究显示:1，3－DCP通过激活NF－КB和MAPK信号转导路径而诱导小鼠黑色素瘤细胞细胞凋亡［12］，但1，3－DCP是否会诱导肝细胞凋亡而产生肝毒性作用未见报道。因此，本研究以HepG2细胞为模型，考察1，3－DCP对 HepG2细胞凋亡的影响和机制，为1，3－DCP肝毒性机制研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

HepG2人肝癌细胞 上海中科院细胞库;MTT、CM－H2DCFDA 美国 Sigma公司;DAPI、Fluo－3、DiBAC4(3) 日本Dojindo公司。

全自动酶标仪(RT－6000) 深圳Rayto公司;激光共聚焦显微镜(FV1000) 日本Olympus公司;倒置荧光数码显微镜(AE31) 深圳Motic公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞活性测定［13］细胞以1×104/孔接种于96孔板，加入1，3－DCP，使其终浓度分别为160、320、640μg/mL，对照组加入同体积培养基。共同培养6h后，加入5%MTT 10μL/孔，继续培养2h后弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，于全自动酶标仪570nm处测OD值。

1.2.2 细胞凋亡检测［14］细胞以1×105/孔接种于24孔板，加入1，3－DCP，使其终浓度分别为160、320、640μg/mL，对照组加入同体积培养基。共同培养8h后，弃去上清，PBS洗2次。加入4%多聚甲醛室温固定10min，加入甲醇(冷)固定20min，5μM DAPI染色液于37℃染色15min，于激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.3 线粒体膜电位测定［15］细胞以1×105/孔接种于24孔板，加入1，3－DCP，使其终浓度分别为160、320、640μg/mL，对照组加入同体积培养基。培养8h，移去培养基。PBS洗2次，加入无血清培养液，荧光探针DiBAC4(3)，37℃标记30min，于荧光显微镜下观察。

1.2.4 细胞内ROS测定［16］细胞以1×105/孔接种于24孔板，加入1，3－DCP，使其终浓度分别为160、320、640μg/mL，对照组加入同体积培养基。共同培养8h后，加 CM－H2DCFDA 5μM在 37℃下培养20min后，加入含有1%胎牛血清的HBSS，继续培养40min。PBS洗2次后加入无血清的培养基再次培养10min，于荧光显微镜下观察。

1.2.5 细胞内钙离子浓度测定［16］细胞以1×105/孔接种于24孔板，加入1，3－DCP，使其终浓度分别为160、320、640μg/mL，对照组加入同体积培养基。培养8h后，移去培养液。PBS洗2次FLUO－3/AM荧光染液3μM，37℃培养20min，于荧光显微镜下观察。

1.2.6 统计分析 每个实验均设3个重复，结果以均值 ±标准偏差(Mean±S.D.)表示，采用 Images Advanced 3.2 software(Motic)软件分割－计算各组光密度值，采用SPSS 13.0软件组间t检验对数据进行分析，p＜0.05，具有显著性差异，p＜0.01，具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 1，3-DCP对HepG2细胞活性的影响

MTT比色法是一种检测细胞活性和增殖的有效方法［17］，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为蓝紫色结晶甲瓚(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，细胞活性越强，产生的甲瓚越多。由图1可以看出，1，3－DCP抑制HepG2细胞的活性，并呈剂量依赖性，说明1，3－DCP以160～640μg/mL剂量作用8h就对HepG2细胞产生毒性作用，尤其剂量大于320μg/mL时毒性更为明显。

2.2 1，3-DCP对HepG2细胞凋亡的影响

细胞凋亡是多细胞生物共有的程序性自动死亡现象，也是毒物导致细胞损伤的常见机制之一［18］。早期凋亡细胞呈现核浓缩，染色加深;晚期凋亡细胞表现为核碎裂成大小不等的圆形小体，即凋亡小体。由图2可以看出，1，3－DCP以160～640μg/mL剂量作用于HepG2细胞8h，使HepG2细胞发生凋亡的形态学改变，可见1，3－DCP能诱导HepG2细胞凋亡。

2.3 1，3-DCP对 HepG2细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的影响

凋亡过程受凋亡信号和基因的精确调控，凋亡

图1 1，3－DCP对HepG2细胞活性的影响Fig.1 Effect of 1，3－DCP on cell variability of HepG2注:与对照组(0μg/mL)比较，

图2 1，3－DCP浓度对HepG2细胞凋亡的影响(600×)Fig.2 Effect of 1，3－DCP concentration on apoptosis of HepG2(600×)

信号通过Caspase依赖性通路，包括线粒体通路、死亡受体通路、内质网通路和凋亡诱导因子等介导的Caspase非依赖性途径诱导细胞凋亡［19］。线粒体在细胞凋亡的过程中的起着枢纽作用，线粒体跨膜电位的降低是细胞凋亡早期的不可逆事件，线粒体膜内外的电势差降低可引起线粒体膜内外一系列的生化改变，如诱导细胞色素C释放，活化caspase蛋白酶家族，呼吸链与氧化磷酸化失耦联，三磷酸腺苷合成停止，线粒体膜通透性改变，凋亡诱导因子(AIF)的释放等，引起细胞凋亡的级联反应，最终导致细胞凋亡［20］。由图3可以看出，随着1，3－DCP剂量的增加，ΔΨm逐渐降低，可见线粒体通路参与了1，3－DCP诱导的细胞凋亡。

2.4 1，3-DCP对HepG2细胞内ROS的影响

ROS对细胞增殖和信号转导具有重要意义，但如果体内ROS过高则会对细胞造成氧化损伤。受损的细胞线粒体产生ROS，机体95%以上的ROS都来自线粒体电子漏［21］，ROS增高与线粒体膜电位的扩散常同时出现。ROS增高可使线粒体通透性转换孔(MPTP)开放，MPTP开放可以将细胞色素C释放至细胞浆，细胞色素C可以激活凋亡蛋白caspase9，caspase9可以激活caspase3，最终引起细胞的凋亡。由图4可以看出，随着1，3－DCP剂量的增加，细胞内ROS含量明显升高，与线粒体膜电位降低一致。

图3 1，3－DCP对HepG2细胞线粒体膜电位的影响(40×) Fig.3 Effect of 1，3－DCP on ΔΨm of HepG2

图4 1，3－DCP对HepG2细胞内ROS的影响(40×)Fig.4 Effect of 1，3－DCP on cellular ROS of HepG2(40×)

2.5 1，3-DCP对 HepG2细胞内钙离子浓度［Ca2+］i的影响

Ca2+是细胞信号转导的第三信使，［Ca2+］i增高与凋亡密切相关。线粒体具有一套完整的Ca2+转运系统，在细胞内钙稳态的维持中起重要作用。一旦线粒体Ca2+转运发生障碍，就会导致细胞内钙稳态紊乱［22］。胞浆高浓度的Ca2+能使线粒体Ca2+摄取增加，ATP合成抑制，线粒体膜电位降低，并能导致线粒体呼吸(电子传递)加速，氧自由基生成增加，导致线粒体内膜脂质过氧化损伤，累及Ca2+－ATP酶及Na+－K+－ATP酶，加重［Ca2+］i浓度，形成恶性循环。由图5可以看出，随着1，3－DCP剂量的增加，细胞内［Ca2+］i含量明显升高，这与前面的实验结果相一致。

3 结论

图5 1，3－DCP对HepG2细胞内钙离子浓度的影响(40×) Fig.5 Effect of 1，3－DCP on［Ca2+］i of HepG2(40×)

本文考察了1，3－DCP对HepG2细胞的细胞活性、细胞凋亡、线粒体膜电位、细胞内ROS含量和［Ca2+］i含量的影响。结果发现，1，3－DCP在160～ 640μg/mL浓度范围内，作用于HepG2细胞8h，就可以降低细胞产生甲瓚的能力，说明1，3－DCP能降低HepG2细胞活性，具有肝毒性作用;细胞凋亡形态学检测结果显示HepG2细胞发生了凋亡的形态学改变，且呈剂量依赖性，可见1，3－DCP的肝毒性作用与其诱导 HepG2细胞凋亡密切相关;同时也发现1，3－DCP剂量依赖地降低线粒体膜电位、增加细胞内ROS和［Ca2+］i含量，说明1，3－DCP影响了线粒体的功能，线粒体功能失常是HepG2细胞凋亡的原因之一。由此可以得出:1，3－DCP能诱导HepG2细胞凋亡，线粒体凋亡通路参与该凋亡过程。

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1，3－DCP induced HepG2 cells apoptosis through mitochondrial signaling pathways

LU Jing，XU Lin－li，WANG Zhen－ning，CONG Wen，HUANG Guo－ren，BU Xiu－juan，GUAN Shuang*
(Department of Food Quality and Safety，College of Light Industry Economics and Management，Changchun University，Changchun 130062，China)

In this paper，the cell variability，apoptosis，mitochondrial membrane potential(ΔΨm)and intracellular calcium content(［Ca2+］i)were evaluated to explain the hepatotoxic mechanisms of 1，3－DCP.The results indicated that 1，3－DCP decreased the cell variability，induced apoptosis，decreased ΔΨm and increased［Ca2+］i at the dose of 160～640μg/mL.Therefore，we could conclude that 1，3－DCP induced HepG2 cells apoptosis through mitochondrial signaling pathways.

1，3－dichloro－propanol;hepG2 human hepatoma cells;htpatotoxic effects;mechanism of action

TS201.2

A

1002－0306(2012)21－0081－04

2012－04－09 *通讯联系人

卢静(1976－)，女，博士，副教授，主要从事食品毒理学研究。

吉林大学基本科研业务费科学前沿与交叉学科创新项目(450060445292)。