陈 雪，王 伟，林 超，杨丽杰

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030)

切达干酪发酵菌种的特性测定及发酵干酪的评价

陈 雪，王 伟，林 超，杨丽杰*

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030)

对实验室研究较为成熟的2株乳酸乳球菌进行发酵产酸、产黏测定，同时对其蛋白水解能力进行评价;并对单菌株、不同比例组合菌株制备的切达干酪进行质构特性评价、感官分析和风味物质测定。测定结果表明:乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4.0424是主要的产酸菌种;与商业发酵剂相比，实验室菌株的蛋白水解能力和产黏能力相对较弱;乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4.0424与乳酸乳球菌乳脂亚种KLDS4.0326按1∶1接种制作的干酪具有良好的成熟度、质地和风味，具备开发成干酪发酵剂的潜力。

干酪，乳酸乳球菌，发酵特性

干酪作为“浓缩”的乳制品，营养丰富且易消化，是生物学价值较高的食品。在西方国家已有上千年的历史，几乎是每餐必备的佳品［1］。切达干酪属于半硬质干酪，是世界干酪生产的主要品种之一，其风味温和、口感适宜，易被中国的消费者接受。目前，开发可被中国消费者接受的风味淡香、口感适宜的干酪，依旧是各大乳制品企业着力研究的重点。干酪的生产过程中，发酵剂发挥着重要的作用，即酸化、稳定结构和风味物质的形成［2］。现今已涌现出一批具有专业化生产规模的知名发酵剂制造商，例如丹麦Hasen公司和Danisco公司等，它们生产的乳品发酵剂性状稳定，形态各异，已成功地应用于各种发酵乳制品的生产。在我国，除西藏的曲拉等传统干酪产品外，国内的干酪生产刚刚起步，生产重心主要停留在再制干酪加工和进口产品分装上［3］。对于干酪发酵剂的研究仍相对落后，存在的突出问题是菌株的工业发酵性能差、活力低、细胞生物量收获少，菌体细胞浓度偏低，这些因素制约着我国干酪发酵剂产业的发展。而干酪直投发酵剂是国内生产干酪的重要原料，目前完全来自进口，这限制了我国干酪产业的发展。本实验通过对实验室研究较为成熟的2株乳酸乳球菌进行单菌株、组合菌株发酵特性测定，并结合中试生产的切达干酪质构、感官评价结果及风味物质分布，给出实验室菌株的特性指标以供参考，为菌株开发成干酪发酵剂提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4.0424(本文简称LA)、乳脂亚种KLDS4.0326(LC)共2株 乳品科学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心(KLDSDICC);直投式干酪发酵剂 丹尼斯克。

鲜奶 东北农业大学农场养殖的荷斯坦奶牛;脱脂乳 德国NORDMILCH AG公司;小牛皱胃酶科汉森。

表1 消费者干酪评价9点喜好尺度法Table 1 Hedonic scale method of measuring cheese preferences

BCN1360型生物洁净工作台 上海佳胜实验设备有限公司;Bohlin Gemini高级旋转流变仪 英国MALVERN公司;TA.XT－2i型质构仪 英国stable micro system 公 司;DU800 Nucleic acid/Protein ANALYZER 美国 Beckman coulter公司;Agillent 6890－5973气相色谱－质谱联用仪、色谱柱:HP－88 (100m×0.25mm×0.20μm) 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验组编制 实验组1为单菌株LA，实验组2为LC，实验组3为组合菌株(其中LA与LC按比例1∶1接种)、实验组4为组合菌株按1∶2接种，实验组5为2∶1接种，对照组为直投式干酪发酵剂(DSC)。

1.2.2 菌株产酸能力测定 将活化第三代的菌株分别以1%的接种量接种于质量浓度为100g/L灭菌脱脂乳中，30℃培养直至凝乳，依据GB5413.34－2010《食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定》测定其酸度，计算产酸速率。

1.2.3 菌株产黏能力测定 将活化第三代的菌株分别以1%的接种量接种于质量浓度为100g/L灭菌脱脂乳中，30℃培养直至凝乳。采用流变仪测定凝乳后在4℃保存24h的发酵乳黏度。选取直径60mm平板，在4℃下测量。

1.2.4 蛋白水解能力测定 取各实验组相同时间点的发酵乳，准确称取2.50g样品置于试管，加入1mL双蒸水混匀，再加入5mL的0.75N三氯乙酸混匀、室温静置 10min，5000r/min离心 10min，取上清液330μL与氨基甲酸酯水解试剂OPA混匀，在室温下反应2min，340nm测其吸光度值［4－5］。

1.2.5 切达干酪的制作 鲜牛乳→进行乳成分分析→过滤杀菌→冷却→添加氯化钙→接种发酵剂→产酸→添加凝乳酶→凝乳→切割凝块→切达化→凝块破碎和盐渍→成型→包装4℃后熟。

1.2.6 成熟后干酪质构评价 取成熟90d的干酪样品，室温下放置2h，进行TPA分析。测量前探头下降速度为2.0mm/s，测试速度为5.0mm/s，测量后探头回程速度为2.0mm/s，下压变形为10mm，触发力为0.2N，探头类型为p/5。

1.2.7 成熟期间干酪风味物质的分析

1.2.7.1 色谱分析条件 程序升温条件:初始温度100℃保持 5min，以 5℃/min升温至 150℃ 保持5min，以8℃/min升温至230℃保持15min，总分析时间40min;色谱柱HP－88，进样口250℃，离子源EI，四级杆温度150℃，传输线温度280℃，载气He，进样模式不分流进样，流速1mL/min，电离方式EI 70eV，质量扫描范围35～500m/z。化合物定量方法:按峰面积归一化法计算化合物的相对质量分数。

1.2.7.2 SPME条件 固相微萃取头PDMS/DVB/ CARB，萃取头解析时间1.5min。

1.2.7.3 样品处理 取样品50g，萃取头吸附时间1.5min。

1.2.8 特定人群对干酪喜好度评价 将6组干酪样品去表皮，在中心区域取样5g左右，随机编号。随机选取10名青年消费者，每个消费者品尝6种干酪后，根据各自喜好对不同菌株发酵干酪进行感官描述并排序，采用9点喜好尺度法进行打分，打分尺度见表1［6］。

2 结果与讨论

2.1 菌株产酸特性的测定

优良干酪发酵剂菌株的选择，产酸速度是关键。由表2可以看出:对照组DSC产酸速度最快，单位时间滴定酸度可增加22.3°T;其次是菌株LA，单位时间滴定酸度增加15.0°T;菌株LC产酸速率最低仅为8.1°T/h;三种不同比例组合菌株之间的产酸速率较为接近，均在8～15.0°T/h之间。结果表明:菌株LA是实验组发酵剂的主要产酸菌种，LC的产酸能力相对较弱;实验组发酵剂产酸性能整体逊色于商业发酵剂DSC，这可以通过增加接种量或添加可应用在干酪生产中的产酸速度较快的菌株弥补不足。有研究表明，发酵剂菌株产酸缓慢，是导致干酪质量差的重要原因之一［2］。凝乳酶的凝乳速度与pH和专一性Ca2+的浓度密切相关。通常情况下，鲜乳的pH是6.7左右，而凝乳酶的最适pH范围是5.0～5.5，低酸度环境还会增加Ca2+的溶解度［7］。因此，在切达干酪的加工过程中，发酵剂的一个重要作用是产酸促进凝乳并且在干酪的后熟过程中，低pH环境可有效抑制致病菌和腐败微生物的生长。

表2 菌株的发酵产酸特性Table 2 Acid－producing activity of strains

2.2 菌株产黏特性的测定

在干酪生产过程中选择产黏适中的菌株是制备优质干酪的另一关键因素。不同实验组发酵质量浓度100g/L脱脂乳的黏度结果如图1所示，对照组DSC发酵产黏584.00mPa·s为最大。相比对照组，实验组的产黏相对较弱，其中单菌株LA黏度值相对较高为 398.35mPa·s，单菌株 LC产黏最低仅为331.90mPa·s。发酵剂产胞外多糖可增加干酪的持水率，提高干酪的产率，但过多的胞外多糖会导致乳清的排除困难［8］。

表4 干酪TPA质构特征分析结果Table 4 Texture profile analysis of cheese

图1 不同实验组黏度值Fig.1 The viscosity value of different experimental groups

2.3 菌株蛋白水解能力的测定

发酵质量浓度为100g/L的脱脂乳，菌株蛋白水解能力测定结果见表3所示，结果表明:蛋白水解的程度会随着发酵时间的增加而增加;其中，对照组发酵剂DSC的蛋白水解吸光值最大，而且6h后增幅较小，表明:对照组蛋白水解能力最强;另外，菌株LA蛋白水解能力强于菌株LC，经过24h的发酵，含有菌株LA的发酵剂水解能力较为接近，且在不同的时间点增幅较大。可以进一步理解为:相同成熟度的干酪，对照组发酵剂DSC所需的成熟时间最短，实验组则成熟缓慢，但成熟期间不同时间段干酪品质变化会比较明显，这有利于对苦味多肽的控制。在干酪成熟过程中，发酵剂分解蛋白质为多肽、胨、氨基酸或其它无机、有机小分子物质，其中不乏必需氨基酸和具有生理作用的活性成分等［9］。这些物质极易被人体吸收，提高了干酪营养价值。但产生的某些小分子多肽具有苦味，影响了干酪的口味。筛选蛋白水解能力相对较弱的菌株，可以使干酪在成熟期间产生较少的苦味多肽，使口味柔和，更利于中国消费者接受。

表3 不同时间蛋白水解能力测定结果Table 3 The results of proteolytic ability in different time

2.4 切达干酪质构的评价

质构是反映干酪成熟期间生化及理化变化的重要指标之一［10］。受发酵剂类型的影响，即使在相同的成熟时间，干酪所表现的质地特征也有所不同。干酪TPA质构特征分析结果见表4。黏着性最大的为对照组DSC干酪，最小是单菌株LC发酵干酪，即对照组干酪的粘附程度要高于实验组，这表明咀嚼该干酪时，干酪对上颚、牙齿等接触面的黏着性大。含有菌株LA的发酵剂黏着性差异不大。凝聚性最大的是单菌株LC发酵干酪，表明咀嚼该干酪时，干酪中酪蛋白抵抗受损并紧密连接的能力最强，干酪保持较好的完整性;咀嚼性最大的是单菌株LA发酵的干酪，反映了该干酪对咀嚼的持续抵抗性最强［11］。硬度是硬质干酪质构分析的主要参数，硬度最大的是单菌株LC发酵干酪，其数值远远高于其他实验组和对照组。这可能是由于干酪制作过程中乳清排除过多，剩余水分较少而引起。这与 Awad［12］等人得出:硬度下降与干酪水分升高有关的结论相类似。综上，实验组与对照组质构差异较大，说明在干酪的口感上实验室发酵剂与商业发酵剂还有很大差别。

2.5 切达干酪风味物质的测定

干酪成熟期间，发酵剂菌体会分解代谢碳水化合物、脂肪和蛋白质，产生具有一定风味的有机和无机小分子物质;同时，菌体细胞出现自溶会释放出多种胞内酶，其中肽酶、蛋白酶等与凝乳酶一起作用分解酪蛋白，使其变成短肽或氨基酸，这些成分直接形成了干酪的风味物质或是成为特定风味物质的前体［9］。干酪成熟3个月后产生风味物质的主要组成及含量见表5所示。其中组合菌株LA∶LC(1∶1)制作的切达干酪可检出的风味物质明显多于对照组和其它实验组。由表5可进一步看出:酮、酸及酯类化合物是干酪风味的主要来源，其中对干酪特征风味组分贡献最大的化合物有7种，即2－庚酮、2－壬酮、2，3－羟基－2－丁酮、n－葵酸、正十二烷酸、葵酸乙酯和2－十一烷酮。酮类物质的风味阈值较低，且在干酪样品中的含量相对较高，整体对干酪的风味贡献较大。其中，3－羟基－2－丁酮赋予了干酪奶香味和脂肪味，这与衣宇佳［13］研究得出的结论一致。

2.6 切达干酪特定人群的喜好度评价

青年消费者对6组干酪的喜好度评价结果见表6所示，消费者对LA单菌株发酵制备的切达干酪表示厌恶，对其感官描述为:风味刺激、味苦、酸味占主要、没有奶香味且有臭味。但整体来看，其它实验组干酪是可以接受的，打分都在5～6之间，感官描述为:口味平淡、略苦、奶油味洁净。尤其是对照组DSC发酵制备的切达干酪奶油味稍重，味香、酸味纯正、苦味较淡，感官评定最高为7.2分。组合菌株LALC(1∶1)组合发酵制备的切达干酪在实验组表现突出，但在风味和口感上与商业发酵剂生产的干酪还有一定的差距。

表5 干酪风味物质的测定结果(%) Table 5 The result of flavor composition(%)

表6 切达干酪特定人群喜好度评价结果Table 6 Specific populations of cheddar cheese preferences evaluation results

3 结论

通过对比单菌株、组合菌株发酵剂与商业发酵剂发酵特性的差异，结合实验组与对照组切达干酪的质构、感官评价及风味物质的测定结果，表明实验室开发的发酵剂与商业发酵剂还有一定差距，但其独特的性质可以通过菌株间复配取长补短。因此，具有开发成符合中国消费者要求的干酪发酵剂潜力。其中菌株KLDS4.0424和KLDS4.0326以比例1∶1组合生产的切达干酪具有良好的成熟度、质地和风味，值得进一步细化和深入研究。

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［13］衣宇佳.国产类契达干酪的风味研究［D］.无锡:江南大学，2008.

Determination of the characteristics of Cheddar cheese fermentation strains and evaluation of fermented cheese

CHEN Xue，WANG Wei，LIN Chao，YANG Li－jie*
(Key Lab of Dairy Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Analysised twolactococcus lactisstrains’fermentation characteristics which included acid－producing ability，extracellular polysaccharide property and proteolytic activity.Texture，flavor components and sensory quality of cheddar cheese which was fermented by single strain and combination withlactococcus lactis sub.lactisKLDS4.0424 andlactococcus lactis sub.cremorisKLDS4.0326 strains were evaluated.All of these strains were researched for a long time in the KLDS.The results showed that KLDS4.0424 was the main acid producing strain.Compared with the commercial starter cultures，the extracellular polysaccharide property and proteolytic activity of laboratory strains were relatively weak.Cheddar cheese had a good maturity，texture and flavor composition which was produced with a ratio of 1∶1 between strain KLDS4.0424 and KLDS4.0326.

cheese;lactococcus lactis;fermentation characteristics

TS252.53

A

1002－0306(2012)21－0074－04

2012－05－03 *通讯联系人

陈雪(1987－)，女，硕士研究生，研究方向:乳品科学与工程。

教育部长江学者和创新团队发展计划(IRT0959)。