王 腾，李 樾，李翠清，*，张亚运，李继文，郭晓燕

（1.北京石油化工学院制药工程系，北京 102617；

2.中国食品药品检定研究院，北京 100050）

响应面分析法优化1-脱氧野尻霉素液相色谱检测的衍生化条件

王 腾1，李 樾2，李翠清1，*，张亚运1，李继文1，郭晓燕1

（1.北京石油化工学院制药工程系，北京 102617；

2.中国食品药品检定研究院，北京 100050）

在1-脱氧野尻霉素的高效液相色谱法分析中，利用响应面分析法优化了荧光衍生化的最佳条件。根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，在单因素实验基础上，以1-脱氧野尻霉素回收率为响应值，应用响应面分析法研究衍生化反应时间、反应温度和衍生化试剂用量各因素间的交互作用及对1-脱氧野尻霉素回收率的影响。确定最佳衍生化条件为：衍生化反应时间22min、衍生化反应温度29℃、衍生化试剂用量0.43mmol/L，实际回收率为99.4%。

1-脱氧野尻霉素，衍生化，响应面分析法，高效液相色谱

1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，1-DNJ）是一种哌啶类生物碱，化学名称3，4，5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，分子式为C6H13NO4。1-DNJ是桑叶中特有的生物碱，是其主要的活性成分之一。现代药理学研究表明，1-DNJ为α-糖苷酶抑制剂，能有效地降低餐后的血糖浓度，起到预防和治疗糖尿病的效果，在食品、医药等领域具有广阔的应用前景[1-3]。1-DNJ分子结构中无苯环、双键、羰基等发色基团，给其定性定量分析带来了一定的困难，目前已报道的分析方法有高效液相色谱-质谱检测法、高效液相色谱-蒸发光散射检测法或高效液相色谱-柱前衍生化法[4-8]。其中，衍生化法因其简便快速，灵敏准确，操作简单且衍生化产物相对稳定而成为常用的方法之一。本文采用荧光试剂芴甲氧羰酰氯（9-fluorenyl-methyl chloroformate，FMOC-Cl）与1-DNJ进行柱前衍生化，以高效液相色谱-荧光检测法进行分离测定。重点对衍生化反应条件进行优化筛选，考察衍生化反应时间、反应温度和衍生化试剂用量对1-DNJ回收率的影响，应用响应面分析法优化衍生化条件，以期建立更为可靠、稳定及灵敏的1-DNJ定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1-脱氧野尻霉素标准品（纯度≥99.0%） 上海同田生物技术有限公司；芴甲氧羰酰氯（纯度≥99.0%） 美国ALDRICH公司；色谱乙腈、甘氨酸、四硼酸钾 国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸 北京化工厂；实验用水 为娃哈哈纯净水；其他试剂 均为分析纯。

Waters2695高效液相色谱系统配有Waters2475荧光检测器和Empower操作系统 美国Waters公司；pHS-25数显酸度计 中国上海精密科学仪器有限公司；AL204-IC分析天平 瑞士梅特勒-托利多集团；电子数字恒温仪 中国金坛恒丰仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 衍生化反应 取一定浓度的1-DNJ标准品溶液20μL置于1.5mL的离心管中，加入0.4mol/L的硼酸盐缓冲液（pH8.5）20μL及一定浓度的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振荡混匀，于一定温度下恒温反应一定时间后，加入1mol/L的甘氨酸溶液20μL，静置5min，让多余的衍生化试剂反应完全。最后加入0.1%（V/V）的醋酸水溶液1.0mL，经0.45μm微孔滤膜滤过后，取10μL进行色谱分析[8]。

1.2.2 高效液相色谱条件 色谱柱：Kromasil C18分析柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%冰醋酸（50∶50，V∶V）；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；荧光检测器激发波长254nm，发射波长322nm；进样体积：10μL。

1.2.3 标准曲线的绘制 取1-DNJ标准品10mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加纯净水适量使其溶解并稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为1.0mg/mL的1-DNJ标准品储备液，于4℃避光保存。分别精密量取上述储备液10、20、50、100、250、500μL，置10mL容量瓶中，分别加流动相稀释至刻度，得到浓度为1、2、5、10、25、50mg/L的1-DNJ标准溶液，衍生化后进行色谱分析，绘制标准曲线。

1.2.4 衍生化反应单因素实验设计 以已知浓度的1-DNJ标准品溶液为研究对象，在1-DNJ衍生化过程中，以1-DNJ回收率为指标，考察衍生化反应时间、反应温度和衍生化试剂用量对衍生化反应的影响，1-DNJ回收率计算方法见式（1）。

1.2.4.1 衍生化反应时间的影响 取50μg/mL的标准品溶液20μL于1.5mL的离心管中，加入0.4mol/L的硼酸盐缓冲液（pH8.5）20μL及0.4mmol/L的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振荡混匀，于30℃水浴中反应不同时间（15、20、25、30、35min），加入1mol/L的甘氨酸溶液20μL，静置5min，让多余的衍生化试剂反应完全。最后加入0.1%（V∶V）的醋酸水溶液1.0mL，经0.45μm微孔滤膜滤过后取10μL进行色谱分析。

1.2.4.2 衍生化反应温度的影响 取50μg/mL的标准品溶液20μL于1.5mL的离心管中，加入0.4mol/L的硼酸盐缓冲液（pH8.5）20μL及0.4mmol/L的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振荡混匀，于不同温度（20、25、30、35、40℃）的水浴中反应20min，加入1mol/L的甘氨酸溶液20μL，静置5min，让多余的衍生化试剂反应完全。最后加入0.1%（V∶V）的醋酸水溶液1.0mL，经0.45μm微孔滤膜滤过后取10μL进行色谱分析。

1.2.4.3 衍生化试剂用量的影响 取50μg/mL的标准品溶液20μL于1.5mL的离心管中，加入0.4mol/L的硼酸盐缓冲液（pH8.5）20μL及不同浓度的（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L）的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振荡混匀，于30℃水浴中反应20min，加入1mol/L的甘氨酸溶液20μL，静置5min，让多余的衍生化试剂反应完全。最后加入0.1%（V∶V）的醋酸水溶液1.0mL，经0.45μm微孔滤膜滤过后取10μL进行色谱分析。

1.2.5 响应面分析实验设计 根据单因素实验结果，采用三因素三水平的响应面分析设计，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理优化衍生化条件，衍生化反应条件及因素水平设计见表1。

表1 响应面分析实验因素水平Table 1 Factors and levels for response surface analysis

1.2.6 数据分析 采用Design Expert软件进行响应面分析[9-11]。

2 结果与分析

2.1 1-DNJ标准曲线

不同质量浓度的1-DNJ标准溶液经高效液相色谱分析，以标准溶液浓度（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得标准曲线如图1所示，线性方程为：Y=558867X-4671，R2=0.9994。结果表明，1-DNJ质量浓度在1～50mg/L的范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。

图1 1-DNJ标准曲线Fig.1 The standard curve of 1-DNJ

2.2 衍生化反应单因素实验

2.2.1 衍生化反应时间的影响 在衍生化反应温度30℃，FMOC-Cl浓度0.4mmol/L条件下，考察衍生化反应时间对1-DNJ回收率的影响，结果见图2。

图2 衍生化反应时间对1-DNJ回收率的影响Fig.2 Effect of derivative time on the recovery of 1-DNJ

由图2可见，当衍生化反应时间为15～35min时，1-DNJ的回收率均可达到85%以上。当衍生化反应时间超过20min时，1-DNJ的回收率随反应时间的延长而下降，可能的原因为反应时间过长，部分衍生化反应产物分解造成了回收率的损失。因此，合适的衍生化反应时间应该在20min左右。

2.2.2 衍生化反应温度的影响 在衍生化反应时间20min，FMOC-Cl浓度0.4mmol/L条件下，考察衍生化反应温度对1-DNJ回收率的影响，结果见图3。

图3 衍生化反应温度对1-DNJ回收率的影响Fig.3 Effect of derivative temperature on the recovery of 1-DNJ

由图3可知，衍生化反应温度在20～30℃范围内，1-DNJ回收率随温度的升高而增大，当温度超过30℃时，回收率呈下降趋势。结果说明衍生化温度过低，衍生化反应不完全，温度过高可能会导致衍生化产物不稳定而使回收率下降。因此，初步确定衍生化反应的适宜温度约在30℃左右。

2.2.3 衍生化试剂用量的影响 在衍生化反应时间20min，衍生化反应温度30℃条件下，考察衍生化试剂用量对1-DNJ回收率的影响，结果见图4。

图4 衍生化试剂用量对回收率的影响Fig.4 Effect of derivatization reagent amount on the recovery of 1-DNJ

图4表明，随着衍生化试剂用量的增加，1-DNJ回收率呈逐渐递增的趋势。在衍生化试剂加入量固定为40μL的条件下，当FMOC-Cl浓度超过0.5mmol/L，衍生化试剂即已过量。因此，初步确定适宜的衍生化试剂浓度为0.4mmol/L左右。

2.3 响应面分析法优化衍生化反应条件

在单因素实验基础上，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，采用三因素水平响应面分析法优化衍生化条件。以随机次序设计进行了17组实验，其中3组区域的中心点（3个零点）重复实验，用以估计实验误差，响应面分析方案及实验结果见表2。

利用Design Expert软件对表2中实验数据进行回归拟合，得到关于衍生化反应时间、反应温度和衍生化试剂用量的模型，回归方程为：Y=97.63+2.59X1+1.27X2+1.33X3-0.56X1X2+1.73X1X3+3.83X2X3-10.87X12-5.20X22-3.33X32，回归方程的方差分析如表3所示。

从方程的方差分析可见，模型p值小于0.01，表明实验选用的模型极显著。模型失拟项p＝0.1162＞0.05，表明失拟项相对于绝对误差不显著，模型选择合适，模型可靠。回归方程相关系数R2=0.9417，说明回收率实际值与预测值之间具有较好的拟合度，方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，仅有约5%的变异不能由该模型解释。

表2 响应面分析实验设计及结果Table 2 Experiments design and results for response surface analysis

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis for the regression model

回归方程系数显著性检验见表4。由表4可知，3个因素的p值相差较大，其中一次项衍生化反应时间（X1）、衍生化反应温度与衍生化试剂用量（X2X3）和二次项衍生化试剂用量（X32）的方程回归系数达到差异显著水平，二次项衍生化反应时间（X12）和衍生化反应温度（X22）的方程回归系数达到差异极显著水平。各因素对1-DNJ回收率影响大小的顺序为：衍生化反应时间（X1）＞衍生化试剂用量（X3）＞衍生化反应温度（X2）。

表4 回归方程系数显著性差异Table 4 Significance test of regression equation coefficients for the regression model

2.4 衍生化条件的响应面分析

为分析任意两因素交互作用的影响，固定任一因素为零水平，考察另两个因素的交互作用即得响应面图如图5所示，响应曲面陡表示交互作用显著，响应面缓则不显著[12-13]。由图5可知，衍生化反应温度与衍生化试剂用量有着显著的交互作用；而衍生化反应时间与衍生化反应温度、衍生化反应时间与衍生化试剂用量的交互作用不显著。

图5 各因素交互作用对1-DNJ回收率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots for the effect of cross-interaction on the recovery of 1-DNJ

2.5 响应面分析结果验证

采用Design Expert软件进行参数最佳化分析，得到1-DNJ衍生化反应的最佳条件为：衍生化反应时间22.3min、衍生化反应温度28.6℃、衍生化试剂浓度0.43mmol/L，对应的1-DNJ理论回收率为99.6%。为检验模型的准确性，以衍生化反应时间22min、衍生化反应温度29℃、衍生化试剂浓度0.43mmol/L进行衍生化反应实验，平行5次实验的1-DNJ实际回收率为99.4%。实测值与理论值无显著性差异，说明采用响应面分析法优化的1-DNJ衍生化条件是可靠的。

3 结论

本文采用单因素实验设计考察了衍生化反应时间、反应温度和衍生化试剂用量对1-DNJ回收率的影响，并在此基础上，利用响应面分析法优化了衍生化条件。建立了衍生化条件与1-DNJ回收率关系的回收模型，经方差分析证明模型合理可靠，能够较好的预测实验结果。利用模型的响应面，对影响因素及相互作用进行了探讨。响应面分析得到的最佳衍生化条件为：衍生化反应时间22min、衍生化反应温度29℃、衍生化试剂浓度0.43mmol/L，实际回收率为99.4%，1-DNJ回收率与理论值无显著差异，表明采用响应面分析法优化1-DNJ的衍生化条件准确可靠，具有较好的应用价值。

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Optimization of derivatization conditions for the determination of 1-deoxynojirimycin by response surface methodology

WANG Teng1，LI Yue2，LI Cui-qing1，*，ZHANG Ya-yun1，LI Ji-wen1，GUO Xiao-yan1
（1.Department of Pharmaceutical Engineering，Beijing Institute of Petro-chemical Technology，Beijing 102617，China；2.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

For the purpose ofestablishing ahighperformanceliquid chromatographymethod forthe determination of 1-deoxynojirimycin（1-DNJ），the optimal derivatization conditions were studied by response surface methodology.Based on the result of single factor experiments，the Box-Behnken design was used to investigate the effect of derivative time，temperature and the amount of derivative reagent on the recovery of 1-deoxynojirimycin.The derivative conditions were found to be 22min，29℃ and 0.43mmol/L and the recovery was 99.4%.

1-deoxynojirimycin；derivatization；response surface methodology；HPLC

R284.1

A

1002-0306（2012）22-0063-05

2012－08－23 * 通讯联系人

王腾（1978－），男，讲师，研究方向：天然产物化学。

教育部科学技术研究重点项目（211003）；北京市教育委员会科技发展计划面上项目（KM201110017002）。