郭开峰 曾 云

1（自贡市第四人民医院 肿瘤科，自贡643000）

2（川北医学院 药理教研室，南充637007）

肿瘤研究者认为肿瘤内部含有一小部分具有自我更新、多向分化潜能的细胞，即肿瘤干细胞［1－3］。这小部分细胞是肿瘤发生、发展、复发、转移、耐药及放疗抵抗的根源［2－4］。因此，分离并对其生物学特性进行研究对肿瘤的诊断、治疗具有重要意义。本实验选取结肠癌细胞株CW－2为研究对象，应用无血清悬浮培养法初步获得肿瘤干细胞，并对其进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

人结肠癌细胞株CW－2购自中国科学院上海生命科学院细胞库；RPMI1640 和DMEM／F12 培养基购自Hyclone公司；胰酶购自Gibco公司；重组人表皮细胞生长因子（Recombinant Human Epidermal Growth Factor，EGF）、重组人白血病抑制因子（Recombinant Human Leukemia Inhibitory factor，LIF）、重组人碱性成纤维生长因子（Recombinant Human fibroblast growth factor－basic，bFGF）购自Sinobio公司；青霉素G、链霉素购自华北制药股份有限公司；Anti－CD44－FITC、Anti－EpCAM－PerCP－Cy5.5和其同型抗体购自BD Bioscience公司。

2 方法

2.1 CW－2细胞在含血清培养基（SSM）中常规培养

将CW－2细胞以105个／ml接种于含10%胎牛血清RPMI1640培养基中。在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，2d换液。待细胞长满瓶底约80%时传代。

2.2 无血清悬浮培养富集CW－2干细胞

2.2.1 将在SSM 中处于对数增长期的细胞以105个／ml接种于无血清悬浮培养液（serum－free medium，SFM）中传代培养。前14d直接向培养瓶中加入培养液，14d后通过胰酶消化法和机械吹打法分离成单细胞悬液后传代。每天观察CW－2 细胞在SFM 中形成肿瘤干细胞球的过程。

2.2.2 向长满瓶底80%的SSM 培养细胞直接换液为SFM，在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，2d换液，观察其生长情况。

2.3 流式细胞检测CD44、EPCAM 的表达

将含血清常规培养、无血清悬浮培养细胞球分别以106个／ml重悬于200μl PBS中，分别加入20 μl的Anti－CD 44－FITC和Anti－EPCAM－PerCP－Cy 5.5。对照组加入同型鼠IgG，避光孵育30 min，1000r／min离心5 min，弃上清，PBS洗2 次，离心弃上清，用200μl PBS 重悬细胞，上机分析。检测CD 44＋EPCAM＋细胞比例。

2.4 细胞分化实验

无血清悬浮培养14d，形成干细胞球后，向培养液中加入胎牛血清，观察肿瘤干细胞球的生长情况。

2.5 细胞周期检测

收集无血清悬浮培养前后的细胞悬液，1000r／min离心5min，弃上清，75%乙醇固定后加solution A 250μl，用手轻击试管将细胞混匀，室温下10min；加solution B 200μl，室温下10min；加solution C 200 μl，混匀，2～8℃10min，上流式细胞仪检测。

2.6 动物致瘤实验

8只4－5周龄NOD／SCID 三联免疫缺陷小鼠由四川大学实验动物中心提供，雌雄各半。完全随机分组法分别分成含血清培养组和无血清悬浮培养组，将含血清培养细胞和无血清悬浮培养细胞收集后调整至所需浓度，按1∶1比例与Matrigel混合，分别以104个细胞数量于右肩胛部皮下接种。每周2次观察肿瘤生长状况，4w 后将小鼠断颈处死，照相后摘取皮下肿瘤。

3 结果

3.1 SFM 培养形成悬浮的肿瘤干细胞球

CW－2细胞接种于SFM 中，第2d大部分细胞贴壁，几乎无死亡细胞（见图1A），第7d时大部分细胞坏死、凋亡崩解，仅有少部分细胞存活下来并形成疏松的悬浮肿瘤干细胞球（见图1B）。新形成的肿瘤干细胞球不规则，新生单个细胞以“出芽”的方式连接在球体上。第14d时细胞球明显较第7d时更大、连接更紧密、不易准确区分细胞与细胞间界限（见图1C）。

3.2 流式细胞学检测

流式细胞仪检测培养收集的无血清悬浮培养前后细胞悬液中干细胞含量。结果显示无血清悬浮培养前后细胞中CD44＋EpCAM＋细胞含量分别为0.36%及60.39%（见图2）。

3.3 细胞分化实验

无血清悬浮培养14天，形成较大细胞球，向培养基中加入胎牛血清，继续培养第2天，悬浮的细胞球就出现贴壁生长（见图3）。

3.4 体内成瘤实验

分别以104个细胞注入NOD－SCID 小鼠右肩胛皮下接种。肿瘤干细胞球组第9d可扪及肿瘤，后逐渐增大（见图4），而SSM 组始终无肿瘤生长。摘取皮下肿瘤，计算成瘤体积，两者之间的差距有统计学意义（P＜0.01）。

图1 无血清悬浮培养富集CD44＋EPCAM＋干细胞Fig.1 Suspended CD44＋EPCAM＋cancer stem cell spheres formed in SFM

图2 流式细胞学检测无血清悬浮培养前后细胞中CD44＋EPCAM＋细胞Fig.2 CD4＋EPCAM＋cancer stem cells were identified by Fluorescence－activated cell sorting

4 讨论

近年来国内外研究表明结肠癌中含一小部分具有自我更新、多向分化潜能的结肠癌干细胞，分离出这一小部分细胞是结肠癌干细胞的实验室研究及结肠癌的临床治疗的关键［4－6］。

无血清条件能够诱导非癌干细胞凋亡坏死，而癌干细胞却能够适应该环境而长期的稳定存活，并形成悬浮的细胞球，根据癌干细胞的这种生长特点，本实验以结肠癌细胞株CW－2 为研究对象，参照Dalerba等［1］的方法，将CD44和EPCAM 作为结肠癌干细胞的表面标志物，运用流式细胞技术分离出具有干细胞特性的CD 44＋EPCAM＋细胞群，检测无血清悬浮培养细胞初步富集结肠癌干细胞中结肠癌干细胞的含量。鉴于结肠癌干细胞具有高分化、高致瘤性，是结肠癌的复发、侵袭、转移的根源［5，6］，故本实验进一步采用细胞分化实验、体内成瘤实验对其进行鉴定。结果表明无血清悬浮培养可以获得CD44＋EPCAM＋细胞含量为60.39%，显著高于富集前的0.36%，该群细胞具有干细胞特性［7，8］。

综上所述，无血清悬浮培养是简单而有效的初步富集结肠癌干细胞的方法，为结肠癌干细胞的生物学性能研究奠定的理论与实践基础。

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