张 旭 曹译心 张翠薇 伍 洋

1（泸州医学院 病理教研室，泸州646000）

2（泸州医学院 组胚教研室，泸州646000）

3（泸州医学院 附属医院 急诊科，泸州646000）

大肠癌的发生发展是多种因素共同作用的结果，包括外界环境，自身因素，抑癌基因或癌基因的缺失、突变、激活及染色体数目和结构的异常改变等。p53 是重要的抑癌基因，p53 基因突变与肿瘤发生发展及患者的预后有关，p53 定位于染色体17p13.1，因此17号染色体的改变也受到越来越多的重视。本研究采用荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）技术检测17号染色体的改变，并对其17号染色体位点存在的P53蛋白表达进行检测，希望能够找出二者之间的相关性，并为大肠癌的预后提供一定的帮助。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集泸州医学院附属医院2012年大肠癌标本67例，所有病例均经术后病理诊断为大肠癌，均为腺癌。其中男性37例，女性30例，中位年龄55岁，其它病理参数见表1。所有病例均为石蜡包埋，4 μm 厚切片。

1.2 FISH 检测

17号（Spectrum red）染色体着丝粒探针，购自美国Vysis公司。4μm 厚石蜡切片一张用于17号染色体FISH 分析。实验步骤如下：常规脱蜡水化，置于梯度酒精脱水，50℃水浴下30%酸性亚硫酸钠预处理30分钟，2×SSC（氯化钠、柠檬酸钠缓冲液）洗涤2 次，37 ℃蛋白酶K 消化10 分钟，依次经70%、85%、100%酒精各脱水2分钟，自然干燥。取10μl探针混合液滴于玻片，加盖玻片，橡胶水泥封片，放入原位杂交仪，37 ℃过夜，杂交后2×SSC 洗涤，暗处自然干燥，滴加二咪基苯基吲哚（DAPI）显色液，盖玻片封片，荧光显微镜观察结果。

1.3 免疫组织化学染色

采用EnVision法，p53单克隆抗体及EnVision试剂盒均购自北京中杉生物工程有限公司。实验步骤按说明书进行。

1.4 结果判读标准

FISH 检测结果判定：低倍选定肿瘤区域，高倍镜下随机计数50个细胞，不计数重叠细胞，细胞核内出现红色信号即为17号染色体倍体情况，细胞核内红色信号≥3个视为多倍体，＜2个信号视为单倍体。

免疫组化判断标准：p53以细胞核呈现棕黄色颗粒为阳性，阳性细胞数＞10%为阳性，＜10%为阴性。

1.5 统计学分析

采用χ2检验，所有数据采用SPSS 11.5统计软件，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 17号染色体异倍体和P53蛋白在肠癌中的表达与临床病理参数的关系

癌组织中17号染色体异倍体31例，其中多倍体29例，单倍体2例（见图1A，B），以多倍体为主。17号染色体异倍体与患者年龄、性别，肿瘤分化程度及淋巴结转移均无关（P＞0.05），只与Dukes分期有关（P＜0.05），17号染色体异倍体在高中低分化癌中的发生率分别为62.5%（10／16），42.9%（12／28），39.1%（9／23）（见表1）。

p53在67例癌组织中的阳性表达率为55.2%（37／67，见图2A，B），与临床病理参数比较，其阳性表达与Dukes分期及淋巴结转移有关（P＜0.05），而与其他临床各参数之间比较显著性差别（P＞0.05），p53在高中低分化癌中的阳性率分别为56.3%（9／16），60.7%（17／28），47.8%（11／23）（见表1）。

表1 17号染色体异倍体与P53蛋白表达与临床病理参数的关系Table 1 Chromosome 17aneuploidy and P53protein expression with clinicopathological parameters

2.2 大肠癌中17号染色体异倍体与p53蛋白表达之间的相关性

17号染色体发现有31例异倍体，其中有14例与p53蛋白阳性表达例数相同，经相关性分析显示，二者之间无显著相关性（P＝0.124）（见表2）。

表2 17号染色体多倍体与P53蛋白表达的相关性Table 2 Correlation of chromosomes 17and P53protein expression

3 讨论

肿瘤的发生发展归根到底是遗传学的变化，其中主要是遗传物质的改变，包括染色体数目结构的异常，染色体的数目异常表现多样，常见有单倍体，三倍体，四倍体及以上等异倍体现象。检测这些染色体的异常多数集中于恶性肿瘤，在大肠癌中，同样存在染色体数目的异常情况，本研究采用FISH 技术检测17号染色体着丝粒在大肠癌中的情况，结果发现，17号染色体在67例大肠癌中有31例发生异倍体，其中多倍体29例，单倍体2例，因此可知大肠癌中17 号染色体异常多数是多倍体状态。有学者［1］对胃癌中的17号染色体的改变进行了研究，结果发现胃癌中同样存在17号染色体多倍体增多的现象，99例中有56例为多倍体，2例为单倍体，与本研究结果基本相似。

早期已有报道［2］，17号染色体断臂丢失是晚期大肠癌的标记，是患者预后不良的指标。本研究检测17号染色体着丝粒的改变，17号染色体改变与临床病理参数比较发现，与患者的年龄、性别及肿瘤的分化程度及淋巴结有无转移均无关，而与Dukes分期有关，我们在比较过程中，反复比对，结果仍然一致，我们分析认为，在大肠癌中，17号染色体异倍体贯穿于癌的发生发展全过程中，可能与患者的预后无关。本结论与早期研究结果不一致，是否与研究例数有关还有待进一步验证。在膀胱癌中研究发现，随着分级的升高，17号染色体多倍体改变显著增加，17 号染色体畸变与膀胱癌的分级呈正相关［3，4］。但本研究统计学分析显示大肠癌中17号染色体改变与肿瘤分化程度无关，因此我们认为在大肠癌中17号染色体的改变只与大肠癌的发生发展有关而与患者的预后无关。虽然未发现有统计学意义，但是可以看出，17号染色体异倍体在高中低分化癌中的发生率依次降低，17号染色体在分化高的肿瘤中发生异倍体的频率较高，这可能提示17号染色体异倍体与肿瘤的早期发生有关。

众所周知，p53是重要的抑癌基因，在多种肿瘤中均表达增高，p53发生基因突变后，失去了控制细胞生长及DNA 修复的作用，使染色体异常改变随着传代不断遗传，最终导致细胞发生恶变，形成肿瘤［5］。本研究发现p53在大肠癌中的阳性表达率为55.2%，稍高于单宝珍等［6］研究结果（48.5%），而低于赵光明等［7］研究结果（66.7%）。我们还发现，p53表达与患者年龄、性别及分化程度无关，但有文献报道［8，9］，30例大肠癌中，p53表达与分化程度有关，这可能与研究例数有关。我们的实验显示p53表达只与Dukes分期及淋巴结转移有关，随着Dukes分期的增加，p53阳性表达例数增加，发生淋巴结转移的病例阳性例数明显高于未发生转移的病例，表明p53阳性表达可能与患者的预后相关，是患者预后差的标记，这与眭怡群等［5］研究结果一致，因此我们提示未发生淋巴结转移的35例中8例阳性的患者应该引起注意，加强随访。

p53是位于17号染色体短臂上的基因，突变型p53的表达是肿瘤发生发展的重要原因［10］，因此17号染色体的改变与肿瘤的发生发展相关，王权等［11］人应用微卫星杂合性缺失的方法发现胃癌中17号染色体可能存在3个与胃癌相关的基因，而p53可能是其中之一，但该研究还需要其他实验进一步证实。本研究采用FISH 方法检测17号染色体着丝粒的改变，结果发现其异倍体的发生率与p53阳性表达率无关，该结果虽然与在乳腺癌中的研究结果［12］相似，但是我们分析认为由于p53 是位于17号染色体上的基因，那么二者之间一定有某种联系，这可能与研究方法和例数有关，也可能是17号染色体还存在其他的与p53相似的基因但尚未发现。

［1］鲁海珍，吴玉鹏，罗巍，等.胃癌17 号染色体异倍体改变及TP53和拓扑异构酶IIα 蛋白过表达与病理诊断的相关性［J］.中华肿瘤杂志，2009，31（10）：754－758.

［2］季晨阳，季丹，Smith DR，等.大肠腺癌17号染色体短臂等位基因丢失的病理意义［J］.第一军医大学学报，1998，18（1）：22－24.

［3］李莉，丁奕星，徐苓，等.染色体3、7、17号和9p21位点在膀胱尿路上皮癌中的畸变情况及其临床意义［J］.诊断学理论与实践，2012，11（1）：47－51.

［4］袁晓亮，甘卫东，姚林方，等.荧光原位杂交技术在膀胱尿路上皮癌诊断中的临床应用［J］.中华腔镜泌尿外科杂志（电子版），2012，6（1）：49－52.

［5］眭怡群，冯一中.自噬相关基因LC3、Beclin－1与凋亡相关基因p53、BCL－2在大肠癌中的表达及意义［J］.临床与实验病理学杂志，2012，28（3）：282－286.

［6］单宝珍，童强，李梅，等.大肠癌发生中突变型P53与hMLHl表达的关系［J］.大连医科大学学报，2009，31（3）：270－273.

［7］赵光明，高泉根，展瑞，等.Hpa、p53和nm23蛋白在大肠癌组织中的表达意义［J］.肿瘤基础与临床，2010，23（2）：118－120.

［8］肖薇.p53在大肠癌中表达的研究［J］.中国当代医药，2010，17（24）：82.

［9］刘伟杰，秦环龙，张惠箴，等.大肠癌中CerbB－2、P53、PCNA蛋白的表达及临床意义［J］.实用医学杂志，2010，26（16）：2928－2930.

［10］Fridman JS，Lowe SW.Control of apoptosis by p53［J］.Oncogene，2003，22（56）：9030－9040.

［11］王权，温玉刚，唐华美，等.胃癌17号染色体抑癌基因候选区域精细定位分析［J］.中华实验外科杂志，2011，28（12）：2148－2451.

［12］Di Leo A，Gancberg D，Larsimont D，et al.HER－2amplification and topoisomerase IIalpha gene aberrations as predictive markers in node－positive breast cancer patients randomly treated either with an anthracycline－based therapy or with cyclophosphamide，methotrexate，and 5－fluorouracil［J］.Clin Cancer Res，2002，8（5）：1107－1116.