彭云吉 张志伟 赵强 刘重元 张婕 陈家明 贺修胜

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma， NPC)是我国南方和东南亚地区高发的恶性肿瘤之一，其发生与EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)感染有着密切的关系[1]。EBV编码的潜伏性膜蛋白1(latent membrane protein 1， LMP1)是公认的致瘤蛋白[2]。笔者前期采用双向凝胶电泳和质谱鉴定，筛选到LMP1调节的Vimentin蛋白[3]，为了解LMP1-CTAR3与调节蛋白质在组织中的相关性，本文采用免疫组织化学染色检测LMP1调节的Vimentin蛋白在鼻咽上皮和鼻咽癌中的表达，拟揭示蛋白质之间的相互作用规律。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2009年8月-2010年10月南华大学附一医院病理确诊的鼻咽上皮组织石蜡块30例(其中男18例，女12例，平均年龄35岁)和鼻咽低分化鳞状细胞癌组织石蜡块60例(其中男41例，女19例，平均年龄44.5岁)。

1.2 免疫组织化学染色 将制备好的石蜡切片58 ℃隔水式恒温培养箱中过夜；二甲苯脱蜡两次后水化；PBS洗片3次，每次3 min；将切片浸入盛有枸橼酸盐缓冲液容器中微波炉加热进行抗原修复；加3%过氧化物酶阻断液，37 ℃ 15 min；PBS洗片3次，每次3 min；加足量非免疫性动物血清，37 ℃ 10 min；分别滴加一抗(抗LMP1蛋白与Vimentin蛋白抗体均为福建迈新生物技术有限公司产品，编号：MAB-0063和 RMA-0547，克隆号：CS1-4和 SP20)，置湿盒中4 ℃冰箱过夜；滴加生物素标记的二抗，37 ℃ 15 min；滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，37 ℃ 15 min；DAB显色、苏木素复染、返蓝、脱水、透明，封片，显微镜观察、照相。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理，Vimentin蛋白的表达采用 χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LMP1蛋白在鼻咽上皮组织及鼻咽低分化鳞状细胞癌中的表达 LMP1主要在细胞膜与细胞浆中表达(结果未显示)，其中鼻咽上皮细胞的表达率为73.3%，而鼻咽低分化鳞状细胞癌中表率为90%，提示慢性鼻炎和鼻咽低分化鳞状细胞癌患者中EBV感染率高。见表1。

2.2 Vimentin蛋白在鼻咽上皮组织与鼻咽低分化鳞状细胞癌中的表达 Vimentin蛋白表达于细胞浆(见图1、2)，与LMP1(-)组织比较，Vimentin蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮组织与鼻咽低分化鳞状细胞癌中表达升高(P<0.05)，提示LMP1促进鼻咽上皮组织与鼻咽低分化鳞状细胞癌中Vimentin蛋白的表达。见表1。

图1 Vimentin蛋白在鼻咽上皮组织中的表达(SP染色法，400倍)

图2 Vimentin蛋白在鼻咽低分化鳞状细胞癌中的表达(SP染色法，400倍)

表1 鼻咽上皮与鼻咽低分化鳞状细胞癌中LMP1蛋白和Vimentin蛋白的表达

3 讨论

鼻咽癌的发生与EB病毒感染、饮食、地理及遗传等因素有关，涉及多基因、多途径和多阶段的复杂生物学过程，属于一种多基因遗传性疾病[1-2]。为了解LMP1在鼻咽癌发生发展中的作用机制，笔者前期工作获得22个LMP1调节的蛋白质，如Vimentin蛋白等[3]。为了证实LMP1对不同蛋白质表达的影响，检测了Vimentin蛋白在鼻咽上皮和鼻咽癌中的表达情况，为阐明LMP1在鼻咽癌发生发展中的作用机制提供了实验依据。

波形蛋白(Vimentin)是一种中间丝蛋白，为细胞骨架成分，广泛存在于间充质细胞及中胚层来源的细胞中，其一端与核膜相连，另一端与细胞表面处的桥粒或半桥粒相连，将细胞核和细胞器维持在特定的空间，主要起支撑作用[4]。Vimentin蛋白在细胞内分布很广，与微管、微丝等形成完整的细胞支撑网络[5]。大量资料表明[6]，Vimentin蛋白在多种人类上皮肿瘤如肾癌、甲状腺、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等异常表达。有研究证实，乳腺癌中Vimentin蛋白表达上调与肿瘤局部浸润和转移存在密切关系[7]。本研究结果显示，Vimentin蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮组织与鼻咽低分化鳞状细胞癌升高，提示LMP1可促进鼻咽上皮与鼻咽低分化鳞状细胞癌中Vimentin蛋白的表达。Vimentin蛋白的表达升高提示，LMP1可促进中间丝表达，诱导肿瘤侵袭和转移，使上皮细胞或癌细胞发生的上皮－间质转化[8]。LMP1介导的上皮－间质转化可能促进恶性增殖前鼻咽上皮细胞的恶变[9]。转化生长因子-β涉及正常上皮-间质转化，伴随着细胞骨架重塑、E-钙粘蛋白表达下降及Vimentin蛋白表达升高[10]。结合鼻咽低分化鳞状细胞癌中EBV的高感染及易早期转移等特点，推测LMP1上调Vimentin蛋白的表达，在促进上皮细胞恶变及在癌细胞转移中起十分重要的作用，但具体机制尚待进一步的研究。

[1] Xu J， Wan X B， Huang X F， et al. Serologic antienzyme rate of Epstein-Barr virus DNase-specific neutralizing antibody segregates TNM classification in nasopharyngeal carcinoma[J]. J Clin Oncol，2010，28(35):5202-5209.

[2] Repic A M， Shi M， Scott R S， et al. Augmented latent membrane protein 1 expression from Epstein-Barr virus episomes with minimal terminal repeats[J]. J Virol，2010，84(5):2236-2244.

[3] 张志伟，张琼，余艳辉，等.EB病毒LMP1-CTAR3对NP69细胞增殖和蛋白表达的影响[J].生物化学与生物物理学进展，2009，36(5):580-586.

[4] Minin A A， Moldaver M V. Intermediate vimentin filaments and their role in intracellular organelle distribution[J]. Biochemistry，2008，73(13):1453-1466.

[5] 郑杰.中间丝与肿瘤病理诊断[J].诊断病理学杂志，1998，5(4):247-249.

[6] Dutsch-Wicherek M. RCAS1， MT， and vimentin as potential markers of tumor microenvironment remodeling[J]. Am J Reprod Immunol，2010，63(3):181-188.

[7] Vora H H， Patel N A， Rajvik K N， et al. Cytokeratin and vimentin expression in breast cancer[J]. Int J Biol Markers，2009，24(1):38-46.

[8] Dong H H， Xiang S， Chen X P， et al. The epithelial-mesenchymal transition promotes transdifferentiation of subcutaneously implanted hepatic oval cells into mesenchymal tumor tissue[J]. Stem Cells Dev，2009，18(9):1293-1298.

[9] Horikawa T， Yoshizaki T， Kondo S， et al. Epstein-Barr Virus latent membrane protein 1 induces Snail and epithelial-mesenchymal transition in metastatic nasopharyngeal carcinoma[J]. Br J Cancer，2011，104(7):1160-1167.

[10] Horikawa T， Yang J， Kondo S， et al. Twist and epithelialmesenchymal transition are induced by the EBV oncoprotein latent membrane protein 1 and are associated with metastatic nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer Res，2007，67(5):1970-1978.