崔柳青，张 璐，张 磊，薛乐勋#

1)河南工业大学生物工程学院郑州450001 2)郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州450001

杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶在真核细胞中的表达*

崔柳青1，2)，张 璐1)，张 磊2)，薛乐勋2)#

1)河南工业大学生物工程学院郑州450001 2)郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州450001

#通讯作者，男，1944年2月生，教授，研究方向:肿瘤与生物工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏盐藻;葡萄糖-6-磷酸异构酶;真核细胞;表达

目的:分别构建杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶(DsGPI)绿色荧光蛋白表达载体和真核表达载体。方法:PCR扩增得到上、下游分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的DsGPI基因，双酶切后与绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1连接，得到重组载体pEGFP-C1-DsGPI，转染狗肾细胞MDCK，观察绿色荧光蛋白在细胞中的定位;同理将上、下游分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的DsGPI基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接，得到pcDNA3.1-DsGPI，转染食管癌EC9706细胞，分别应用RT-PCR法和Western blot法检测DsGPI mRNA和蛋白的表达。结果:DsGPI在MDCK细胞中定位于细胞核，在EC9706细胞中被有效表达。结论:成功构建了DsGPI的绿色荧光蛋白表达载体和真核表达载体。

葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase，GPI)是在糖代谢过程中起重要作用的一种酶，其催化葡萄糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸之间的相互转化，并普遍存在于原核和真核生物中。近年来的研究证实，GPI是一种非常保守的酶［1］，不仅参与机体内的糖代谢，而且还具有一些其他作用［2］，如在动物细胞中作为自分泌运动因子(AMF)促进肿瘤细胞增殖浸润［3］。在藻类细胞中GPI可能参与了鞭毛相关功能的执行［4］，而藻类鞭毛已被作为研究鞭毛/纤毛与疾病的一种模型［5］。目前对杜氏盐藻GPI尚未有深入研究的报道，其作为鞭毛相关蛋白是否与其他鞭毛相关蛋白一样在真核细胞中发挥作用，是否也能影响一些疾病尤其是肿瘤都很值得探讨。该研究构建了杜氏盐藻GPI(DsGPI)的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-DsGPI和真核细胞表达载体 pcDNA3.1-DsGPI，研究 DsGPI在狗肾细胞MDCK中的定位，并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达，为进一步探讨其在真核细胞中的生物学功能提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与质粒 MDCK细胞购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司，EC9706细胞、真核绿色荧光表达载体pEGFP-C1、人GPI绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-GPI、人GPI真核表达载体pcDNA3.1-GPI和大肠杆菌DH5α均由该研究室保存。

1.1.2 工具酶及主要试剂 LA Taq DNA聚合酶，限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及反转录试剂盒均购自大连宝生物公司;无内毒素质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Axygen公司;T4 DNA连接酶购自Promega公司;转染试剂脂质体2000、RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司;RPMI 1640培养液购自Gibco公司;兔抗人GPI抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗DsGPI多抗由该研究室制备保存，二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.3 引物 根据DsGPI全序列，设计用于构建绿色荧光表达载体的一对引物:F1(5’-CCGGAAT TCATGTTGTCCAACTTCAAGCAGG-3’)和 R1(5’-CGCGGATCCTCATGGCAGCGAATCCACAG-3’)，同理设计用于构建真核表达载体的一对引物F2(5’-CGCGGATCCATGTTGTCCAACTTCAAGCAGG-3’)和R2(5’-CCGGAATTCTCATGGCAGCGAATCCACAG-3’)，在其上下游分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。设计用于半定量RT-PCR的引物，见表1。引物由北京博尚生物技术有限公司合成。

表1 用于RT-PCR的引物序列

1.2 pEGFP-C1-DsGPI和 pcDNA3.1-DsGPI的构建

1.2.1 杜氏盐藻cDNA的合成 取对数生长期的盐藻细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA。取5 μg RNA作模板，加入反转录试剂盒中的随机引物并使总反应体积为20μL。70℃变性5min后迅速冰浴，依次加入4μL 反应缓冲液，2μL dNTP混合物，1μL RNase inhibitor，37 ℃ 5min 后加入 1μL MMLV逆转录酶，37℃ 60min，70℃10min，结束反应。

1.2.2 PCR扩增 取上述逆转录产物cDNA为模板，分别用引物F1和 R1、F2和R2进行PCR扩增。反应体系:cDNA 模板 1μL，10 × Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上、下游引物各 0.25μL，LA Taq DNA聚合酶 0.25μL，无菌水 18.75μL。反应条件:95℃预变性5min;94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2min，30个循环;72℃延伸5min;4℃终止反应。

1.2.3 载体的构建及鉴定 用EcoRⅠ、BamHⅠ分别双酶切PCR产物、pcDNA3.1(+)和pEGFP-C1，经琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果后回收、纯化目的片段，将基因片段分别与对应的载体片段经16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒并行双酶切鉴定，得绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-DsGPI和真核细胞表达载体pcDNA3.1-DsGPI。将初步鉴定正确的菌液送北京博尚生物技术有限公司测序以确定读码框是否正确。

1.3 pEGFP-C1-DsGPI在MDCK细胞中的定位将EMEM培养基粉末溶于1 L三蒸水中，加入5 g NaHCO3，混合均匀调整酸碱度至 pH 7.2 ～ 7.4，0.22 μm滤膜过滤，4℃储存备用。用含体积分数10%胎牛血清及双抗的EMEM完全培养基培养MDCK细胞，细胞培养条件为体积分数5%CO2、37℃。培养至细胞密度达80%左右时，严格按脂质体2000的说明书无菌技术操作要求，转染pEGFP-C1-DsGPI。以转染pEGFP-C1、pEGFP-C1-GPI的细胞为对照。转染24 h后，荧光显微镜下通过蓝光激发观察EGFP在细胞中的分布。

1.4 pcDNA3.1-DsGPI在 EC9706 细胞中的表达①EC9706细胞用含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基培养。培养至细胞密度达80%左右时，分别转染 pcDNA3.1-DsGPI、pcDNA3.1-GPI和空载体 pcDNA3.1(+)，转染方法同 1.3。转染后 12、24、48 和72 h分别收集细胞并提取RNA，进行PCR扩增，检测DsGPI mRNA。②根据RT-PCR结果，确定转染最佳时间，收集细胞并提取总蛋白，经SDS-PAGE电泳，电转蛋白到硝酸纤维素膜上，用GPI抗体及DsGPI多克隆抗体进行Western blot分析，暗室曝光显色。

2 结果

2.1 DsGPI cDNA全长的扩增 用Trizol试剂提取杜氏盐藻细胞总RNA，电泳显示为18 S、28 S两条带，紫外分光光度计测定A(260 nm)/A(280 nm)≥1.8，说明其纯度和完整性符合 RT-PCR要求。RT-PCR扩增出DsGPI cDNA全长，电泳结果显示片段长度与NCBI登录的杜氏盐藻DsGPI cDNA长度一致(图1)。

图1 DsGPI基因全长的RT-PCR检测结果

2.2 DsGPI表达载体的鉴定 重组表达载体pcDNA3.1-DsGPI和 pEGFP-C1-DsGPI分别经 EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后，电泳出约2 kb的DNA条带，说明目的基因DsGPI已经插入对应载体中(图2)。经测序，插入片段长度正确且读码框无误。

2.3 DsGPI在MDCK细胞中的定位 转染空质粒pEGFP-C1的MDCK细胞绿色荧光分布整个细胞，而转染pEGFP-DsGPI和pEGFP-GPI的MDCK细胞绿色荧光均定位于细胞核区域。

2.4 pcDNA3.1-DsGPI在 EC9706 细胞中的表达转染 pcDNA3.1-DsGPI、pcDNA3.1-GPI的 EC9706细胞中GPI和DsGPI mRNA的表达水平均较未转染和空载体转染细胞升高，并且在24 h时升高最明显(图3)。收集转染后24 h的细胞进行Western blot分析，结果显示转染 pcDNA3.1-GPI和 pcDNA3.1-DsGPI的EC9706细胞中GPI和 DsGPI均能被有效表达，且表达水平高于未转染和空载体转染细胞(图4)。

图4 EC9706细胞转染24 h后目的蛋白的表达情况

3 讨论

越来越多的证据表明，鞭毛/纤毛异常与肿瘤等疾病的发生发展密切相关［6］，并且以莱茵衣藻为模式生物已经进行了一系列鞭毛/纤毛与重要疾病因子的关系的研究［7］。DsGPI是盐藻鞭毛相关蛋白，深入研究DsGPI对肿瘤细胞的影响具有重要意义。哺乳动物细胞中GPI是个复杂的多功能蛋白，它不但参与糖酵解和糖异生等糖代谢过程，还具有以下功能，促进人类髓细胞性白血病细胞和B细胞的成熟，促进胚胎脊柱生长，参与精子凝集和神经发育等，而最重要的是其能作为自分泌运动因子促进肿瘤细胞的运动［8］。因此，深入研究DsGPI的功能首先要使其在真核细胞中稳定表达。

DsGPI的关键酶活位点以及预测的三维结构都跟人GPI一致［9］，但研究DsGPI与人GPI生物学功能上的差异需要更多证据。该实验通过绿色荧光蛋白表达载体证实DsGPI在MDCK细胞中的定位和人的GPI定位非常相似:集中在细胞核区域，在胞质其他部位也有分布。这是因为与GPI相互作用的底物大多分布在内质网和线粒体上［10］，而细胞核周围的内质网和线粒体中分布有较多的GPI底物，大量的荧光融合蛋白与底物结合使得此区域绿色荧光富集。该研究初步证明了DsGPI能在MDCK细胞中的细胞核区域表达和定位，这为在其他细胞中研究DsGPI功能提供了可行性依据。该研究中作者构建了DsGPI的真核表达载体pcDNA3.1-DsGPI，并证实该载体可在食管癌EC9706细胞中有效表达，这为深入研究其在真核细胞中的功能奠定了基础。

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(2012-03-28收稿 责任编辑王 曼)

Expression of Dunaliella salina glucose-6-phosphate isomerase in eukaryotic cells

CUI Liuqing1，2)，ZHANG Lu1)，ZHANG Lei2)，XUE Lexun2)
1)College of Bioengineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001 2)Laboratory for Cell Biology，Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;glucose-6-phosphate isomerase;eukaryotic cell;expression

Aim:To construct Dunaliella salina glucose-6-phosphate isomerase(DsGPI)green fluorescent protein expression vector and eukaryotic expression vector.Methods:The complete cDNA sequences of DsGPI was cloned into the plasmid pEGFP-C1 to create a recombinant plasmid pEGFP-C1-DsGPI by using BamHⅠ and EcoRⅠ sites and identified.Localization of the EGFP fusion proteins was examined by fluorescence microscopy after the recombinant plasmids were transfected in MDCK cells.Recombinant plasmids pcDNA3.1(+)-DsGPI were constructed with the same method and transfected in EC9706 cells，DsGPI mRNA was detected by RT-PCR and DsGPI protein were examined by Western blot.Results:EGFP fusion proteins were mainly localized in the nucleus area in MDCK cells and expression of DsGPI increased in EC9706 cells.Conclusion:DsGPI green fluorescent protein expression vectors and eukaryotic expression vectors has been constructed successfully.

Q781

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.04.003

*国家自然科学基金资助项目 31000580