陈璐，万秀娟，尹花，贺扬，林洪

1(中国海洋大学食品安全实验室，山东青岛，266003)

2(啤酒生物发酵工程国家重点实验室(筹)，山东青岛，266061)

抗氧化啤酒酵母菌株TK-10的选育及工业生产验证*

陈璐1，2，万秀娟2，尹花2，贺扬2，林洪1

1(中国海洋大学食品安全实验室，山东青岛，266003)

2(啤酒生物发酵工程国家重点实验室(筹)，山东青岛，266061)

以啤酒酿造Lager酵母TS-01为出发菌株，依次利用含乙硫氨酸、羟基正缬氨酸的平板进行定向育种，利用硝酸铅平板分离出高产SO2、低产H2S的菌株，然后通过EBC管、100 L中试发酵试验，以发酵液的SO2、H2S、双乙酰、乙醛、高级醇的含量和发酵度为筛选指标，得到1株发酵性能优良的菌株TK-10。以出发菌株TS-01为对照进行600 t大生产对比验证，表明新菌株TK-10的SO2产量明显升高，成品酒抗氧化性能得到改善，且口感良好，保持原有风味不变。

Lager酵母，抗氧化，SO2，产物反馈抑制

啤酒在贮藏期间风味都会逐渐发生变化，或多或少产生一些异味，这些异味被认为来自啤酒的氧化过程，通常称之为“氧化味”，俗称“老化味”[1］。老化味的产生是啤酒风味稳定性变差的感官表现，也是影响啤酒质量和保质期的主要因素之一。SO2是一种具有高抗氧化作用的化合物，是提高啤酒内源抗氧化力最有效的途径[2］，其对啤酒新鲜度的贡献主要体现在两方面[3］:(1)SO2具有与酶反应产物耦合的特性，对氧的亲和力非常大，在极短的时间内可以将氧祛除从而起到抗氧化剂的作用[4］;(2)SO2可以和不饱和醛类形成加合物以掩饰啤酒的老化味。

冷贮酒中SO2和H2S都是发酵过程酵母进行甲硫氨酸合成的中间代谢产物[5］，与SO2的抗氧化效应不同，H2S具有臭鸡蛋气味，同时也是其他含硫的会导致异味组分的前驱体，因此在成品酒中的含量控制越低越好。甲硫氨酸生成量的逐渐积累会对SO2产生一种叫做“产量积累反馈抑制”的生物机制，但由于SO2与H2S的代谢生成量具有同向效应，仅通过发酵工艺调整很难达到既提高SO2产量、又降低H2S产量的目的。目前国内外研究者对于高产SO2酵母菌株的选育，主要是通过控制亚硫酸盐代谢途径上的几种基因来完成，如高水平表达MET3和MET14基因[6］，通过硫酸根离子同化途径来增加SO2的产量;或者是通过破坏MET10基因或MET2基因来增加SO2产量[7-8］。但基因工程菌株目前在实际啤酒生产过程尚无法应用，因此此类研究一般仅限于中试水平研究。

为了获得高产SO2、低产H2S酵母菌株，同时该菌株又能应用于啤酒实际生产，本文以生产用Lager酵母菌株TS-01为出发菌株，先利用甲硫氨酸的结构类似物乙硫氨酸进行第一步定向育种，筛选出能够解除甲硫氨酸反馈抑制的菌株(具备高产SO2、高产H2S的能力);再利用苏氨酸的结构类似物羟基正缬氨酸进行二次定向育种，筛选出能够解除苏氨酸反馈抑制的菌株(具备高产SO2、低产H2S的能力)，并以发酵液的SO2、H2S、双乙酰、乙醛、高级醇的含量和发酵度为筛选指标，获得1株发酵性能优良，品评口味与出发菌株基本相同，而SO2产量提高、H2S产量不变，且抗氧化性能大为提高的优良菌株TK-10。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基

出发菌株:生产用Lager酵母菌株TS-01，中国海洋大学食品安全实验室。

抗性培养基1:0.17%无添加氨基酸及硫氨酸的酵母氮源，0.5%硫酸铵，2%葡萄糖，0.1%硝酸铅，10 mg/L的DL-乙硫胺酸，2%琼脂。115℃灭菌20 min。

抗性培养基2:0.17%无添加氨基酸及硫酸铵的酵母氮源，0.5%硫酸铵，2%葡萄糖，100 mg/mL的羟基正缬氨酸，无菌膜过滤。

硝酸铅培养基:0.5%的酵母粉，0.3%蛋白胨，4%葡萄糖，0.02%硫酸铵，0.1%硝酸铅，2%的琼脂，115℃灭菌20 min。

麦汁培养基:13°P麦汁，115℃灭菌20 min。

1.2 主要仪器

酵母计数仪，美国BECKMAN COUNTER公司;啤酒全自动分析仪，奥地利ANTON PAAR公司;气相色谱仪，美国Perkin Elmer公司、美国GE公司;生化培养箱，日本SANYO公司;Lambda 2S分光光度计，PERKIN ELMER公司;e-scan电子自旋共振仪，德国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 测定方法

发酵度测定:啤酒全自动分析仪检测。

生长速度的测定:采用浊度法，用分光光度计以水为空白600 nm检测吸光值，以吸光值代表菌株的生长速度。

硝酸铅平板筛选:H2S与平板中的铅离子反应生成的硫化铅为黑色，H2S产生的越多，黑色越明显。因此可以根据菌落的颜色快速判断出H2S的产量。

双乙酰含量的测定:气相色谱法[9］。

风味物质的测定:气相色谱法[9］。

SO2的测定:盐酸副玫瑰苯胺法。

H2S 的测定:气相色谱法[10］。

ESR的测定:电子自旋共振仪[11］。

1.3.2 乙硫氨酸抗性菌株的选育

从保存的斜面上挑取少量酵母，接种到盛有5 mL麦汁培养基的试管里，在25℃条件下培养24 h。将培养好的酵母培养液涂布在抗性培养基1的平板上，25℃培养，每天观察酵母生长情况，10天后平板出现暗红色小菌落。根据酵母菌落形态，选取生长较快、边缘整齐、形态饱满的菌落于13°P麦汁培养基中，25℃培养48 h后，置于4℃冰箱保存。

1.3.3 羟基正缬氨酸抗性菌株的选育

将活化好的菌株，分别接1环于5 mL麦汁培养基中，25℃培养72 h，将得到的酵母培养液于3000 r/min离心5 min，除去上清液，加入10 mL无菌水洗涤2遍，重新悬浮于5 mL无菌水中，取100 μL加入到2 mL抗性培养基2中，25℃培养5 d。

1.3.4100 L 中试试验

100 L发酵罐中装13°P麦汁60 L，接入逐级扩大培养的扩培液6 L。9.5℃发酵，12℃进行双乙酰还原。

1.3.5 工业生产验证

为了进一步考察其工业应用价值，以出发菌株TS-01为对照，进行600T规模的工业生产验证。9.5℃发酵，12℃进行双乙酰还原。每天跟踪发酵液中的SO2、H2S、双乙酰、乙醛、高级醇、高级酯含量及发酵度的变化。

2 结果与讨论

2.1 抗氧化啤酒酵母菌株的选育

2.1.1 乙硫氨酸抗性菌株的选育

2.1.1.1 初筛

在抗性培养基1的平板上共挑取30支菌株，通过3次重复涂布，选择生长快、菌落大小一致、且菌落颜色较深的菌株11支进行硝酸铅平板筛选。从硝酸铅平板上选择黑色呈现最明显的4支菌株A1、A4、A7、A18进行复筛。出发菌株及初筛菌株(以A1为例)在硝酸铅平板上的生长情况对比见图1，通过颜色对比表明初筛菌株的SO2、H2S产量得到提升。

图1 初筛前后菌株在硝酸铅平板上的生长对比

2.1.1.2 复筛

将A1、A4、A7、A18四支菌株进行EBC管发酵试验(共进行两轮)，结果见表1。从表1可见，4株乙硫氨酸抗性菌株的SO2产量均高于出发菌株，根据两轮EBC管发酵试验结果选择SO2产量较高且稳定A1菌株进行下一步试验。

表1 乙硫氨酸抗性菌株选育的EBC管发酵试验

2.1.2 羟基正缬氨酸抗性菌株的选育

将经过羟基正缬氨酸抗性培养的A1菌株稀释、涂布硝酸铅平板，25℃培养，每天观察生长情况。从硝酸铅平板上挑取边缘整齐、形态饱满且颜色较浅的菌落于5 mL麦汁培养基中，25℃培养36 h后，4℃保存。共计挑取菌株30个，同时将新菌株重新编号为B1-B30。通过生长浊度实验选择11支菌株进行硝酸铅平板涂布及EBC管发酵试验，发酵结束检测SO2，数据见图2。

图2 羟基正缬氨酸抗性选育的EBC管发酵试验

由图2数据可以看出，除个别菌株SO2产量比出发菌株TS-01低之外，大部分菌株SO2产量均有不同程度的提高。选取SO2产量较高且在硝酸铅平板上菌落生成颜色较浅的菌株B9、B15、B21进行下一步试验。

2.2100L中试试验

为进一步筛选性能优良的菌株，将B9、B15、B21三支菌株进行100 L中试试验，试验结果见表2。由表2中数据可以看出，新选育的3支菌株SO2产量均比出发菌株高，H2S产量基本持平。菌株B15的SO2产量比出发菌株TS-01提高180.64%，H2S产量下降28.91%，发酵度、成熟度与风味指标基本相同，因此选择B15菌株重新命名为TK-10，进行下一步遗传稳定性验证。

表2100 L中试冷贮酒结果

2.3 遗传稳定性验证

为了验证抗氧化菌株TK-10的稳定性，将其连续传10代，然后分离出单菌落，随机挑选4个菌株进行BBC管发酵试验，测定发酵液中SO2、H2S、双乙酰、乙醛、高级醇、高级酯含量及发酵度指标，取其平均值分别为 8.15 ppm、11.25 ppb、34.25 ppb、6.41 ppm、104.69 ppm、25.73 ppm、65.54%，与第1代菌株 TK-10发酵各项指标相差不多，即可认定菌株TK-10主要发酵特性遗传稳定，具体数据见表3。

表3 抗氧化菌株TK-10的遗传稳定性分析

2.4 工业生产验证

2.4.1 发酵过程酵母数的变化

发酵过程酵母数的变化如图3所示。抗氧化菌株TK-10还原后期酵母细胞数较出发菌株TS-01高，但冷贮酒酵母数与对照相差不大。

2.4.2 发酵过程降糖变化

发酵过程中的降糖变化如图4所示。抗氧化菌株TK-10与出发菌株TS-01降糖过程无明显差异。

2.4.3 冷贮酒SO2及H2S含量

图3 抗氧化菌株TK-10及其出发菌株TS-01在600 t大生产发酵过程中酵母细胞数的变化

图4 抗氧化菌株TK-10及其出发菌株TS-01在600T大生产发酵过程降糖曲线

冷贮酒中的SO2及H2S含量变化如表4所示。抗氧化菌株TK-10的冷贮酒SO2含量约为出发菌株TS-01的2.6倍，而H2S产量却基本等同，说明在实际大生产规模下抗氧化菌株TK-10仍能保持其高产SO2、低产H2S的特性。

表4 冷贮酒SO2及H2S含量

2.4.4 成品酒发酵指标

成品酒的发酵指标见表5。由表5可见，使用抗氧化菌株TK-10进行发酵得到的啤酒发酵度较成品酒略高，成熟度指标比使用原出发菌株TS-01的要好，这与还原后期TK-10的酵母细胞数比TS-01高有关。风味指标两者之间相差不大。

表5 成品酒成熟度及风味指标

2.4.5 成品酒抗氧化性能

成品酒的抗氧化性能如图5。由图5可见，不管是新鲜酒还是强化实验后，利用抗氧化菌株TK-10进行发酵得到酒LT值均比原出发菌株TS-01的要高，说明通过提高酵母菌株SO2产量后其成品酒抗氧化性能确实得到有效提升。

图5 新鲜酒及强化实验后的ESR指标

2.4.6 啤酒的感官品评

抗氧化菌株TK-10生产的啤酒经国家级啤酒评酒委员品评，认为整体风格与出发菌株相比保持一致，口感协调、爽口。将经过35℃7天强化处理的酒进行风味稳定性品评，评委一致认为抗氧化菌株TK-10生产的啤酒风味稳定性明显优于出发菌株，具体品评结果见表6。

表6 成品酒进行强化试验后新鲜度品评结果

风味稳定性评分标准如下:分值为1-10分，其中9-10分为新鲜、6-8分为轻微氧化、3-5位中度氧化、1-2分为严重氧化。

3 结论

采用含乙硫氨酸、羟基正缬氨酸的平板进行定向育种，通过EBC管、100L中试发酵试验得到1株SO2产量高、H2S产量低，各项发酵性能良好的菌株TK-10。通过遗传稳定性试验及600T大生产规模发酵验证，表明其遗传性能稳定，在工业生产环境下仍能保持其高产SO2的能力，SO2产量比出发菌株提高2～3倍，成品酒抗氧化性能得到改善，且保持其原有口感及风味不变，在安全有效提高啤酒风味稳定性方面具有良好的应用前景。

[1]王志沛，高灵燕，王孔云.成品啤酒的风味稳定性[J］.食品与发酵工业，1997，23(1):47-51.

[2]Kaneda H，Kimura T，Kano Y，et al.Role of fermentation conditions on flavor stability of beer[J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1991，72(1):26-30.

[3]Guido L F.How do sulfites help to control beer ageing?[J］.Cerevisia，2005，30(2):132-138.

[4]Dufour J P，Carpentier B，Kulakumba M，et al.Alteration of SO2production during fermentation[J］.Proc EBC Con gr，1989:331-338.

[5]Nordlow H.Formation of sulphur dioxide during beer fermentation[J］.Proc E B C Con gr，1985:291-298.

[6]Korch C，Mountain HA，Gyllang H，et al.A mechanism for sulphite production in beer and how to increase sulphite levels by recombinant genetics[J］.Proc E B C Con gr，1991:201-208.

[7]Hansen J，Kielland-brandt M C.Inactivation of MET2 inbrewer’s yeast increases the level of sulfite in beer[J］.J Biotech，1996，50(1):75-87.

[8]Hansen J，Kielland-brandt M C.Inactivation of MET10 in brewer’s yeast specifically increases SO2formation during beer production [J］.Nat Biotech，1996，14:1587-1591.

[9]王家林，解彬，张伟，等.啤酒风味物质气相色谱分析技术的研究[J］.啤酒科技，2001(2):17-18.

[10]贺立冬，杨静静，刘月琴，等.啤酒中挥发性含硫化合物的检测方法及啤酒硫化味品尝的相关性研究[J］.啤酒科技，2010(2):43-47.

[11]孙治福，郝俊光，张宇昕，等.Lag-Time、二氧化硫与啤酒新鲜度的关系[J］.啤酒科技，2009(7):34-38.

ABSTRACTBrewer’s lager yeast strain TS-01(Saccharomyces pastorianus)was selected as parent strain for directed breeding with resistance induction on medium containing ethionine and hydroxynorvaline successively.Mutant stains with high SO2and low H2S production were obtained by screening with medium containing lead nitrate.The mutants were fermented in EBC tube and 100L tank for pilot fermentation respectively using the content of SO2，H2S，diacetyl，aldehyde，higher alcohols and the fermentation degree as the selecting indexes.As a result，TK-10 was obtained as strain with optimal fermentation performance.Industrial fermentation was conducted in 600T tank with the parent strain TS-01 as a control.The results showed that TK-10 was obviously increased in the production of SO2with improved antioxygenic property of beer product.In addition，the beer flavor was maintained with good sensory evaluation.

Key wordsLager yeast，antioxygenic property，SO2，product feed-back inhibition

Screening of Brewer’s Yeast Strain TK-10 with High Antioxygenic Property and Its Industrial Fermentation

Chen Lu1，2，Wan Xiu-juan2，Yin Hua2，Lin Hong1
1(Food Safety Laboratory，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)
2(State Key Laboratory of Biological Fermentation Engineering of Beer(in preparation)，Qingdao 266061，China)

博士研究生(林洪教授为通讯作者，E-mail:linhong@ouc.edu.cn)

*国家973项目(2012CB723707)资助

2012-02-10，改回日期:2012-05-24