翟光华，李美芬，朱超望

（苏州市立医院北区 检验科，江苏 苏州 215008）

血清载脂蛋白A5ELISA的建立及其初步应用

翟光华，李美芬，朱超望

（苏州市立医院北区 检验科，江苏 苏州 215008）

目的 建立人血清中载脂蛋白A5（ApoA5）双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA），并初步观察其在2型糖尿病（T2DM）中的应用价值。方法用棋盘滴定法确定捕获抗体、检测抗体的最佳工作浓度；绘制标准曲线，确定线性范围、检测限；检测该方法的精密度和特异性，并分别检测T2DM患者及健康人血清中ApoA5水平以及其它生化指标。结果本研究建立的方法测定范围为5－640ng／ml，最低检出量2ng／ml，批内和批间变异系数（CV）分别为5.6%和6.7%。T2DM患者血清中ApoA5水平为（494.2±233.1）ng／ml，显著低于健康对照组（668.2±357.0ng／ml，P＝0.001）；血清 ApoA5浓度与 HDL-c呈正相关（r＝0.16，P＝0.031），与TG呈负相关，但是没有达到统计学差异（r＝－0.028，P＝0.717）。结论本研究建立的人血清ApoA5双抗体夹心ELISA灵敏度高，特异性好，可应用于临床ApoA5的检测；ApoA5可能是T2DM的独立危险因素，监测ApoA5浓度对于T2DM的预防和干预具有一定临床意义。

载脂蛋白A5；酶联免疫吸附试验；糖尿病；血脂

（ChinJLabDiagn，2012，16：1755）

载脂蛋白A5（ApoA5）是2001年由两个独立课题组［1，2］在 APOA1／C3／C4基因簇中发现并被证实的一个载脂蛋白家族新成员，其参与调节血脂代谢，尤其与三酰甘油（TG）关系密切，是对血浆TG水平影响最为显著的因子之一。2型糖尿病（T2DM）是一种常见病与多发病，常伴有脂质代谢紊乱。我们先前的研究［3，4］发现，载脂蛋白 A5基因（APOA5）多态性与T2DM发生有关。本研究采用基因工程技术获得大量 His-ApoA5重组蛋白，免疫Balb／c小鼠，制备抗ApoA5的单克隆抗体。建立ApoA5－ELISA双抗体夹心法，对实验条件和影响因素进行了探索，并初步应用于临床检测，探讨ApoA5蛋白水平与T2DM之间的关系。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器Balb／c小鼠（苏州大学实验动物中心提供）、SP2／0骨髓瘤细胞株（江苏大学检验医学研究所惠赠）；弗氏佐剂、羊抗鼠-HRP二抗、辣根过氧化物酶（HRP）（美国Sigma公司）；四甲基联苯胺（TMB）、BSA（上海晶美生物技术有限公司）；全自动酶标分析仪（上海科华）。

1.2 一般资料本院2010年3－11月体检中心健康人员112例，男72例，女40例，平均年龄（42.5±14.6）岁，排除各种急性应激状态（如急性心梗、脑梗、感染、外伤、手术等），肝肾功异常，甲状腺功能异常以及血常规 WBC≥10.0×109／L和空腹血糖FG≥6.11mmol／L者。选择同期我院内分泌科确诊的T2DM患者62例（参考WHO1999标准诊断）作为病例组，男26例，女36例，平均年龄（59.5±15.9）岁。所有研究对象清晨空腹采集静脉血3ml，离心取血清备用。

1.3 方法

1.3.1 抗ApoA5单抗的制备 ①动物免疫：常规免疫法免疫Balb／c小鼠，第1次用完全佐剂，第2、3次用不完全佐剂，进行腹腔注射。②细胞融合：取免疫小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞在50%聚乙二醇（PEG）的作用下10∶1比例进行融合，10d后检测抗体，选取阳性孔，采用有限稀释法克隆化，待克隆阳性率100%时，扩大培养，获得7株稳定分泌抗ApoA5单抗的亚克隆细胞株，选取其中3个OD值高的阳性细胞株制备单抗腹水，ProteinA亲和层析法纯化抗体。③抗体特异性测定：固相载体分别包被 ApoA5、ApoA1、ApoB和人血清白蛋白，用ELISA法测定。抗体的Ig及亚类鉴定采用双相免疫扩散法。④抗体的效价测定：取上清和腹水，用0.9%氯化钠溶液稀释成不同浓度，用ELISA法测定其效价。

1.3.2 ApoA5ELISA测定方法的建立 利用1.3.1制备的抗ApoA5单抗，建立双抗体夹心法ELISA，并对实验条件进行优化。利用棋盘方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体的使用浓度。

1.3.3 其他生化指标检测 TG、TC和Glu采用酶法测定；HDL-c、LDL-c采用化学遮蔽法测定；LP（a）、ApoA1、ApoB和CRP采用免疫比浊法测定。所有指标均在Beckman Coulter LX20全自动化学分析仪上进行，所用试剂均为配套试剂。

1.3.4 统计学分析 用SPSS18.0统计软件包进行统计分析。所有检测指标均进行正态性检验，各计量资料均采用均数±标准差（±s）表示。采用Pearson相关分析计算相关系数。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 包被抗体与酶标抗体工作浓度的选择

为确定制备的ApoA5检测单抗和包被单抗的最佳工作浓度，采用棋盘方阵法进行滴定。以阴性对照A450nm值＜0.1，ApoA5检测单抗的A450nm值为1.0时的稀释度为最佳工作浓度，以此标准确定检测单抗的工作浓度为1∶1 000，包被单抗工作浓度为1∶2 000时曲线效果最佳。

2.2 ApoA5蛋白标准曲线及检测限确定

以本实验优化好的ELISA方法，检测已知浓度的经系列稀释的重组ApoA5蛋白，通过ApoA5浓度的与A450nm值绘制曲线图（图1），可知ApoA5在5－640ng／ml浓度范围内具有良好的线性，并且包括了7个标准点，确定此范围为该方法的检测范围。通过对选定范围内的7个标准点线性回归，获得标准曲线，被检抗原浓度在该浓度范围内能形成一条近似线性曲线（图2），回归方程Y＝189.329X－16.662，R2＝0.994。

图1 ApoA5浓度与A450nm值关系图

图2 ApoA5测定标准曲线

2.3 方法学考核①检测限：以方阵滴定法所确定的最佳浓度配比检测梯度稀释的重组ApoA5蛋白，得本方法的检测限。当重组ApoA5蛋白为2 ng／ml时阳性／阴性（P／N值）＞2.1，故该双抗体夹心ELSIA检测限为2ng／ml。②精密度：两份不同血清样本同批连续测定8次，批内平均CV为5.4%和5.9%，平均批内CV为5.6%；两份样本分6次测定，其批间CV分别为6.5%和6.8%，平均批间CV为6.7%。③ELISA特异性实验：以新建立的双抗体夹心ELISA法进行BSA、ApoA1以及人血清白蛋白与ApoA5单抗特异性检测，没有发现交叉反应，表明该ELISA方法具有良好的特异性。

2.4 初步临床应用

检测所有对象血清ApoA5浓度，如表1所示。T2DM 组血清 ApoA5浓度为494.2±233.1ng／ml，显著低于健康对照组（668.2±357.0ng／ml，P＝0.001）。按性别分组后，这种差异女性（485.6±238.3ng／ml vs 672.2±349.0ng／ml，P＝0.009）较男性（506.2±229.9ng／ml vs 666.0±363.8ng／ml，P＝0.039）更为明显。然而，在健康对照组和T2DM组，男性血清ApoA5浓度与女性血清ApoA5浓度无明显差异（P＞0.05）。总人群中，女性血清ApoA5浓度（583.8±314.0.sng／m1）低于男性（623.6±339.9ng／ml），但无显著性差异（P＝0.430）。在总人群，血清ApoA5浓度与BMI、CRP和年龄均呈负相关，相关系数r分别为－0.36、－0.17和-0.23（P＜0.05），与 HDL-c呈正相关（r＝0.16，P＝0.031）。ApoA5与TG呈负相关，但是没有达到统计学差异（r＝－0.028，P＝0.717），与其它血脂指标无明显相关性。这种相关性男性和女性无明显差别。

表1 研究对象血清ApoA5浓度的比较（ng／ml）

3 讨论

动物实验和临床研究证明ApoA5在体内TG代谢过程中发挥重要作用，敲除APOA5基因小鼠的血浆TG水平约是正常对照的4倍，同时伴有极低密度脂蛋白（VLDL）的升高；相反，转入人APOA5基因的小鼠，其血浆TG水平下降66%，VLDL亦有下降；这些表明ApoA5表达与TG呈高度负相关［1，2］。而ApoA5仅在肝脏中表达，血浆中的浓度非常低，不到 ApoA1的0.1%［2］。因此，建立一种灵敏度高、特异性强的检测方法具有重要的临床意义。

本文建立的双抗体夹心ELISA仅对ApoA5反应，与其他无关抗原无交叉反应，检测灵敏度，重复性好，批内和批间变异低，检测方法准确可靠。本研究检测中国人血清ApoA5浓度发现健康人血清ApoA5浓度为668.2±357.0ng／ml，与Pennacchio等［1］报道的血清ApoA5浓度一致，但比高加索人和日 本 人 的 ApoA5 浓 度 高［5，6］。 这 与 一 些 报 道APOA5SNP的稀有等位基因在亚洲人包括中国人中更多见不一致，这种差异的出现考虑可能与种族差异有关。

本文研究结果显示，T2DM组血清ApoA5浓度降低，与以前的报道ApoA5多态性中稀有等位基因伴有T2DM危险增加一致，揭示血清ApoA5降低与T2DM的危险增加相关，不依赖于血脂、BMI、年龄等已知的T2DM 危险因素，提示血清ApoA5浓度可能为T2DM危险的独立预测因子。然而，ApoA5在T2DM的作用机制目前尚不清楚。ApoA5在TG代谢中激活脂蛋白脂酶（LPL）促进脂解作用和增加VLDL的清除，可以解释ApoA5的保护作用［7，8］。

［1］Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing.Science，2001，294：169.

［2］Van der Vliet HN，Sammels MG，Leegwater ACJ，et al.Apolipoprotein A-V：a novel apolipoprotein associated with an early phase of liver regeneration.J Biol Chem，2001，276：44 512.

［3］Zhai G，Wen P，Guo L，et al.Association of c.553G＞T Polymorphism in Apolipoprotein A5Gene with Type 2Diabetes Mellitus in Chinese Population.Clin Chem Lab Med，2006，44（11）：1313.

［4］翟光华，闻 平，郭兰芳，等.2型糖尿病患者 APOA5-1131T／C基因多态性与血脂代谢和胰岛素抵抗的关系研究［J］.遗传，2007，29（5）：541.

［5］Ishihara M，KujiraokaT，IwasakiT，et al.A sandwich enzymelinked imnrunosorbent assay for hurnan plasma apolipoprotein AV concentration.J Lipid Res，2005，46：2015.

［6］O’Brien PJ，Alborn WE，Slona JH，et al.The novel apolipoprotein A5is present in human serum，is associated with VLDL，HDL，and chylomicrons，and circulates at very low concentrations compared with other apolipoproteins.Clin Chem，2005，51：351.

［7］Alborn WE，？Prince MJ，Konrad RJ.Relationship of apolipoprotein A5and apolipoprotein C3levels to serum triglycerides in patients with type 2diabetes.Clin Chim Acta，2007，378（1-2）：154.

［8］Qi L，Liu S，Rifai N，et al.Associations of the apolipoprotein A1／C3／A4／A5gene cluster with triglyceride and HDL cholesterol levels in women with type 2diabetes.Atherosclerosis，2007，192（1）：204.

Development of an ELISA method for the determination of human serum apolipoprotein A5and its preliminary clinical ap－ plication

ZHAIGuang-hua，LIMei-fen，ZHUChao-wang.（DepartmentofLaboratoryMedicine，theNorthDistrictofSuzhouMunicipalHospilal，Suzhou215008，China）

ObjectiveTo develop a double antibody sandwich enzyme-linked immunoassay（ELISA）for the detection of human apolipoprotein A5（ApoA5）and study its preliminary clinical application in type 2diabetes mellitus（T2DM）.MethodsThe best work concentration of the capture antibody and detection antibody was decided by the board titration method.The standard curve of ELISA was established to determine the linear range and detection limit.The precision and specificity of the method was determined.The serum ApoA5level and other biochemical indicators were detected in T2DM patients and healthy individuals respectively.ResultsIt was found that the measurement range of this method was 5－640ng／ml，and the minimal detectable limit was 2ng／ml，and the intra and inter-coefficients of variation（CV）was 5.6%and 6.7%.The serum ApoA5level of T2DM patients was（494.2±233.1）ng／ml，which was significantly lower than the healthy individuals（668.2±357.0ng／ml，P＝0.001）.The Pearson correlation analysis showed that the serum ApoA5level was positively correlated with the serum level of HDL-c（r＝0.16，P＝0.031），and negatively correlated with the serum level of TG，but statistical difference was not found（r＝－0.028，P＝0.717）.ConclusionThe double antibody sandwich ELISA is a sensitive，specific method for quantitative analysis of human serum ApoA5level.ApoA5may be independent risk factor for T2DM.It may have potential clinical significance in prevention and intervention of T2DM to monitor the serum ApoA5level.

apolipoprotein A5（ApoA5）；enzyme-linked immunoassay（ELISA）；diabetes mellitus；serum lipid

R466.11＋2

A

1007－4287（2012）10－1755－03

苏州市“科教兴卫”青年人才专项基金（SWK0924）；南京医科大学科技发展基金面上项目（09NJMUM138）

2011－03－20）