庞有旺 郑季南 洪庆南 方 钧

（解放军泉州第180医院骨科，泉州 362000）

近年来已经证明的囊泡膜谷氨酸转运体有三种亚型［1～3］。其中Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体广泛、互补地分布于大脑皮质、丘脑、延髓和脊髓等中枢神经系统的谷氨酸能神经终末内［3～5］。目前已经把Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体作为谷氨酸能轴突终末的特异性标识物。生理学研究表明谷氨酸是作用三叉神经运动核神经元的主要神经递质，参与咀嚼、吮吸等活动［6～7］，但有关谷氨酸阳性终末在三叉神经运动核的分布模式到目前未见报道。因此，本研究综合应用束路追踪与免疫荧光组织化学相结合技术，对Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体阳性纤维在大鼠三叉神经运动核内的分布进行了研究。

材料和方法

1.Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体和神经元核蛋白免疫荧光组织化学染色

雄性SD大鼠6只，体重250－280g。戊巴比妥钠腹膜腔麻醉（40mg/kg）后，戊巴比妥钠深麻下，插管至升主动脉，先以100ml 0.025mol/L的PBS冲洗血液，再用500ml含4%多聚甲醛和75%饱和苦味酸的0.1mol/L的PB灌注固定，持续30min以上。灌毕立即取脑，并置入上述新鲜固定液中后固定4－6h，然后再移脑入含30%蔗糖的0.1mol/L的PB（pH 7.3）中，至其沉底。冰冻切片机行冠状切片，片厚25μm，分为2套收集。

第1套切片用于Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体和神经元核蛋白免疫荧光三重染色。具体步骤如下：①小鼠抗神经元核蛋白IgG（1∶1000；MAB377；Chemicon）和兔抗Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体IgG（0.8μg/ml，日本京都大学金子武嗣先生惠赠）和豚鼠抗Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体IgG（0.8 μg/ml，日本京都大学金子武嗣先生惠赠）的混合液室温下孵育过夜；②生物素结合的驴抗兔IgG（10 μg/ml；Jackson，West Grove，PA）室温下孵育3 h；③10%兔血清、Alexa647标记的山羊抗小鼠（10 μg/ml；Molecular Probes）、Alexa594标记的驴抗豚鼠IgG （10μg/ml；Molecular Probes）、Alexa488标记的Avidin D（10μg/ml；Molecular Probes）的混合液中室温下孵育2h。抗体孵育液如前所述。

第2套切片用于对照实验。用正常血清替代一抗血清进行免疫荧光组织化学染色，结果为阴性。

上述染色结果在激光共聚焦显微镜FV1000，Olympus，Japan）下观察Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体阳性纤维在三叉神经运动核内分布（Alexa488的激发光波长488nm，发射光波长510－525nm；Alexa594的激发光波长594nm；发射光波长575－640 nm；Alexa647的激发光波长647nm，发射光波长700－720nm。

2.四甲基罗达明束路追踪结合Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体和神经元核蛋白免疫荧光组织化学染色

雄性SD大鼠6只，体重250－280g。戊巴比妥钠腹膜腔麻醉（40mg/kg）后，手术暴露一侧下颌舌骨肌神经，微量注射器抽取2－3μl含10% 的四甲基罗达明水溶液，注入神经内。动物存活4－5天后，戊巴比妥钠腹膜腔麻醉（40mg/kg）后，戊巴比妥钠深麻下，插管至升主动脉，先以100ml 0.025mol/L的PBS冲洗血液，再用500ml含4%多聚甲醛和75%饱和苦味酸的0.1mol/L的PB灌注固定，持续30min以上。灌毕立即取脑，并置入上述新鲜固定液中后固定4－6h，然后再移脑入含30%蔗糖的0.1mol/L的PB（pH 7.3）中，至其沉底。冰冻切片机行冠状切片，片厚25μm，分为2套收集。

第1套切片用于Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体和神经元核蛋白免疫荧光双重染色。具体步骤如下：①小鼠抗神经元核蛋白IgG（1∶1000；MAB377；Chemicon）和兔抗Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体IgG（0.8μg/ml，日本京都大学金子武嗣先生惠赠）的混合液室温下孵育过夜；②生物素结合的驴抗兔IgG（10 μg/ml；Jackson，West Grove，PA）室温下孵育3 h；③10%兔血清、Alexa647标记的山羊抗小鼠（10 μg/ml；Molecular Probes）、Alexa488标记的 Avidin D（10μg/ml；Molecular Probes，Eugene，OR）的混合液中室温下孵育2h。抗体孵育液如前所述。

第2套切片用于对照实验。用正常血清替代一抗血清进行免疫荧光组织化学染色，结果为阴性。

上述染色结果在激光共聚焦显微镜FV1000，Olympus，Japan）下观察Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体阳性纤维在三叉神经运动核内分布（Alexa488的激发光波长488nm，发射光波长510－525nm；四甲基罗达明的激发光波长568nm；发射光波长570－610nm；Alexa647的激发光波长647nm，发射光波长700－720nm。）

结 果

神经元核蛋白标记的三叉神经运动核神经元胞体较大，与周围标记神经元对比鲜明，因而整个三叉神经运动核边界清楚（图A）；Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体标记的神经元终末在三叉神经运动核背外侧部呈中等密度分布，在三叉神经运动核的腹内侧部没有分布（图B），而Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体标记的神经元终末在三叉神经运动核背外侧部和腹内侧部均呈高密度分布（图C）；在三叉神经运动核内，未见Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体双重标记的神经元终末，Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体标记的神经元终末个体明显大于Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体标记的神经元终末（图D）。

四甲基罗达明注射入下颌舌骨肌神经逆行标记的开口神经元聚集于三叉神经运动核的腹内侧部，与位于三叉神经运动核的背外侧部的闭口神经元胞体聚集区界限清楚。此时，我们可以清楚地观察到在三叉神经运动核内没有Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体阳性终末分布的区域正好是开口神经元胞体聚集区域（图F）。

讨 论

谷氨酸是中枢神经系统中的主要兴奋性神经递质，作为负责转用谷氨酸到囊泡内的囊泡膜谷氨酸转运体近年引起神经科学研究者的关注［1～5］。已经有较多形态学、生理学证据表明谷氨酸参与调控咀嚼活动［10～12］，囊泡膜转运体抗体阳性终末在三叉神经运动核的分布模式具有重要研究意义。本研究则通过免疫组织化学结合逆行标记观察了Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体在三叉神经运动核不同区域的确切分布，我们观察到Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体在三叉神经运动核的闭口神经元聚集区域内中等密度分布，在开口神经元聚集区域内没有分布，而Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体在整个三叉神经运动核内均高密度分布。

已往的生理学研究表明从三叉神经中脑核到三叉神经运动核之间存在直接的单突触兴奋性通路，也存在间接的多突触兴奋性通路，从大脑皮层到三叉神经运动核之间只存在间接的多突触兴奋性通路［14～15］。以往的形态学研究表明三叉神经运动核内的Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体阳性终末为三叉神经中脑核神经元的中枢突终末［13］。本研究我们观察到Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体在三叉神经运动核不同区域差异分布，其中一个显著特征就是在三叉神经运动核的腹内侧区未见Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体阳性终末分布，我们进一步逆行标记了开口神经元，明确三叉神经运动核内没有Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体阳性终末分布的区域为开口神经元区。因而，本研究结果表明Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体在三叉神经中脑核到闭口神经元间的单突触反射通路中发挥作用，而Ⅱ型囊泡膜谷氨酸转运体则在大脑皮层或三叉神经中脑核等核团到三叉神经运动核开口和闭口神经元的多突触通路中发挥作用。

［1］Ni B，Wu X，Yan GM，et al.Regional expression and cellular localization of the Na＋－dependent inorganic phosphate cotransporter of rat brain.J Neurosci，1995，15：5789－5799

［2］Bellocchio EE，Hu HL，Pohorille A，et al.The localization of the brain－specific inorganic phosphate transporter suggests a specific presynaptic role in glutamatergic transmission.J Neurosci，1998，18：8648－8659

［3］Fujiyama F，Furuta T，Kaneko T.Immunocytochemical localization of candidates for vesicular glutamate trans－porters in the rat cerebral cortex.J Comp Neurol，2001，435：379－387

［4］Li JL，Fujiyama F，Kaneko T，et al.Expression of vesicular glutamate transporters，VGluT1and VGluT2，in axon terminals of nociceptive primary afferent fibers in the superficial layers of the medullary and spinal dorsal horns of the rat.J Comp Neurol，2003，457：236－249

［5］Li JL，Xiong KH，Dong YL，Fujiyama F，Kaneko T，Mizuno N.Vesicular glutamate transporters，VgluT1 and VGluT2，in the trigeminal ganglion neurons of the rat，with special reference to coexpression.J Comp Neurol，2003，463：212－220

［6］Scott G，Westberg KG，Vrentzos N，et al.Effect of lidocaine and NMDA injections into the medial pontobulbar reticular formation on mastication evoked by cortical stimulation in anaesthetized rabbits.Eur J Neurosci，2003，17：2156－2162

［7］Nakamura Y，Katakura N，Nakajima M.Generation of rhythmical ingestive activities of the trigeminal，facial，and hypoglossal motoneurons in in vitro CNS preparations isolated from rats and mice.J Med Dent Sci，1999，46：63－73

［8］Nozaki S，Iriki A，Nakamura Y.Localization of central rhythm generator involved in cortically induced rhythmical masticatory jaw－opening movement in the guinea pig.J Neurophysiol，1986，55：806－825

［9］Turman Jr JE，Chandler SH.Immunohistochemical localization of glutamate and glutaminase in guinea pig trigeminal premotoneurons.Brain Res，1994，634：49－61

［10］Turman Jr JE，Ajdari J，Chandler SH.NMDA receptor NR1and NR2A/B subunit expression in trigeminal neurons during early postnatal development.J Comp Neurol，1999，409：237－249

［11］Turman Jr JE，MacDonald，AS，Pawl KEW，et al.AMPA receptor subunit expression in trigeminal neurons during postnatal development.J Comp Neuro，2000，l 427：109－123

［12］Turman Jr JE，Hiyama L，Castillo M，et al.Expression of group I and II metabotropic glutamate receptors in trigeminal neurons during postnatal development.Dev Neurosci，2000，23：41－54

［13］Pang YW，Ge SN，Nakamura K，et al.Axon Terminals Expressing Vesicular Glutamate Transporter VGLUT1or VGLUT2Within the Trigeminal Motor Nucleus of the Rat：Origins and Distribution Patterns.J Comp Neurol l，2009，512：595－612

［14］Luo PF，Moritani M，Dessem D.Jaw－Muscle Spindle Afferent Pathways to the Trigeminal Motor Nucleus inthe Rat.J Comp Neurol，2001，435：341－353

［15］Nozaki S，Iriki A，Nakamura Y.Localization of central rhythm generator involved in cortically induced rhythmical masticatory jaw－opening movement in the guinea pig.J Neurophysiol，1986，55：806－825.