姚路明 (长春前进医院，吉林 长春 130062)

大肠癌是胃肠道最常见的恶性肿瘤之一，在我国近几年发病率明显上升〔1〕。随着生物科学及医学水平的提高，肿瘤生物治疗取得了迅速发展，是继手术、化疗、放疗后又一重要的治疗手段。生物治疗应用细胞生物学和分子生物学手段对机体免疫系统或肿瘤生长进行调控，从而抑制肿瘤生长〔2〕。本研究观察超抗原SEA对SW480细胞增殖抑制率，旨在为大肠癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 SW480细胞株由吉林省肿瘤研究所惠赠，SEA由军事医学科学院微生物流行病研究所提供。噻唑蓝(MTT)试剂、RPMI1640培养基为美国Sigma公司产品，胎牛血清购于长春生物制品研究所。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 取指数生长期的SW480细胞，调细胞数为2×105/ml，接种于96孔塑料培养板内100 μl/孔，当细胞生长达到80%汇合时，每孔内分别加入不同浓度的SEA溶液0、20、40、80 ng/ml，每个浓度 10 复孔，静止培养 24 h，于结束前6 h加入MTT试剂20 μl/孔，终浓度为500 mg/L，继续培养6 h后加入二甲基亚砜150 μl/孔，振荡5 min，使MTT还原产物完全溶解，于酶标仪570 nm波长处测量各孔吸光度A值，按下列公式计算SW480细胞增殖抑制率。SW480细胞增殖抑制率=(1－加药孔细胞A值÷对照孔细胞A值)×100% 。

1.2.2 流式细胞术 细胞培养及分组同1.2.1，不同之处是将96孔塑料培养板改为50 ml培养瓶，培养后经0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞PBS洗二次，70%冷乙醇固定，4℃内保存，上机前过40目尼龙网，调细胞数为1×106/ml，PI染色，流式细胞仪检测，结果以Modifi 2.0软件分析。

1.2.3 透射电子显微镜 细胞培养及分组同1.2.2，培养结束后分别收集不同浓度SEA作用的SW480细胞，离心弃上清，沉淀细胞经2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铅－铀双重染色，透射电子显微镜观察并拍照。

1.3 统计学分析 采用SPSS11.0软件分析，组间比较采用t检验、F检验。

2 结果

2.1 MTT结果 不同浓度的SEA对SW480细胞增殖均有抑制作用，且呈剂量依赖性，与对照组相比差异显著(P＜0.01)。见表1。

表1 不同浓度的SEA对SW480细胞增殖抑制率(±s)

表1 不同浓度的SEA对SW480细胞增殖抑制率(±s)

组别 A值 抑制率 P值1.52±0.12 － －20 ng/ml组 1.24±0.14 18.5% ＜0.01 40 ng/ml组 0.95±0.17 37.6% ＜0.01 80 ng/ml组0 ng/ml组0.83±0.24 41.5% ＜0.01

2.2 流式细胞术结果 不同浓度的SEA对SW480细胞增殖周期均有影响，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，且细胞凋亡率升高。见表2。

2.3 透视电子显微镜结果 图1可见，20 ng/mlSEA组SW480细胞肿胀，有空泡形成;40ng/mlSEA组SW480细胞脆质呈条索状，线粒体肿胀;80 ng/ml SEA组SW480细胞核染色质趋边、凝集，可见凋亡小体。

表2 不同浓度的SEA对SW480细胞周期进程影响(±s，%)

表2 不同浓度的SEA对SW480细胞周期进程影响(±s，%)

32.5±2.1 63.2±3.6 4.3±1.9 1.6 20 ng/ml组 44.6±3.8 39.8±4.7 15.6±2.6 11.2 40 ng/ml组 54.2±4.4 26.5±3.3 19.3±2.1 17.8 80 ng/ml组凋亡率0 ng/ml组组别 G0/G1 S G2/M 59.6±4.2 18.2±3.1 22.3±3.7 20.4

图1 透视电子显微镜观察各组SW480(×5 000)

3 讨论

SEA是一组对热稳定的可溶性蛋白质，能抵抗胃肠液中蛋白水解酶的水解作用，是食物中毒和毒素性休克的常见病因〔3〕。SEA属于外源性超抗原物质，不需加工直接与MHCⅡ类分子结合形成配体，通过该配体抑制细胞增殖，同时作为超抗原物质可刺激机体免疫系统产生淋巴因子，参与机体免疫应答反应。

本研究中MTT结果显示不同浓度的SEA对SW480细胞的增殖抑制具有明显的剂量依赖性，流式细胞仪结果显示，不同浓度的SEA对SW480细胞周期进程均有影响。SEA具有直接的细胞毒效应，能够抑制G1期细胞向S期细胞转化进程，使G1期细胞堆积，不能进入S期，停止于G1期，造成S期细胞减少，从而使G2/M期细胞相对增多，而G2/M期细胞增多是细胞损伤的普遍反映〔4〕。G1期细胞又称细胞复制前期，G1期制造和产生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白体，同时G1期也是多种化学药物作用的敏感点〔5〕。因此，抑制G1期细胞的进程，从而使细胞增殖变缓，可达到抑制肿瘤增殖的目的〔6〕。

综上所述，本研究应用SEA直接作用于SW480细胞，获得较为满意的结果。证明SEA具有直接的细胞毒作用，可用于肿瘤的局部治疗。

1 高 巍，刘尚梅.结直肠神经内分泌肿瘤的研究进展〔J〕.国际肿瘤学杂志，2011;38(9):693-6.

2 刘 娣，许晓群，王郡甫.IL-24的生物学特征及其抗肿瘤作用机制〔J〕.国际肿瘤学杂志，2010;37(9):657-61.

3 Thomas D，Chou S，Dauwalder O，et al.Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins〔J〕.Chem Immunol Allergy，2007;93:24-41.

4 Eillnger Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Celss，2000;5(6):491-8.

5 Martin LG，Demers GW，Galloway DW.Disruption of the G1/S transition in human Papiloma Viras type/6 E7-expressing human cells in associated regulation of cyclin E〔J〕.J Virol，1998;72(2):975-85.

6 Jie KG，Jiang H，Sun L，et al.The pilot study of anti-tumor effects versus immunosuppression of Staphylococcal Enterotoxin C〔J〕.Cancer Biol T-her，2007;6(10):1584-91.