张 云 彭玄杰 张 兴

(1.台州市第一人民医院,浙江 黄岩 318020；2.广东省中医院,广东 广州 510120)

近年来研究表明胃癌的发生发展与Sonic hedgehog信号通路的异常激活有关,以往对胃癌发生发展过程中Sonic hedgehog信号通路异常激活机制的研究主要集中于信号通路的上游配体Shh及其受体Ptch上,发现胃癌组织中存在Shh及Ptch的高表达,并推测胃癌的发生可能与Sonic hedgehog信号通路上游配体Shh及其受体Ptch高表达有关,但相关研究结果却不能解释作为抑癌基因的Ptch在胃癌组织中高表达的现象。Smo蛋白是Sonic hedgehog信号通路中的信息转换器,对Sonic hedgehog信号通路具有激活作用,其在胃癌组织中的表达以及与胃癌发生发展的关系,目前尚不清楚。

本研究以正常胃黏膜组织作对照,检测Smo mRNA及蛋白在胃癌组织中的表达状况,分析胃癌组织中Smo表达水平与患者临床及病理特征的关系,并进一步探讨在Sonic hedgehog信号通路中,Smo蛋白对于与胃癌的辅助诊断及预后判断的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 68例胃癌及距离病灶5cm处正常胃黏膜组织标本来自浙江省台州市第一人民医院2010年2月至2011年10月的胃癌手术病例,其中男43例,女25例,年龄28～75岁,平均(55.4±3.5)岁,所有入选病例术前均未接受放疗、化疗等先期治疗措施,并严格按照TNM分期标准分为四期。手术标本部分用石蜡包埋,部分于-80℃冰箱保存、备用。

1.2 方法 实时荧光定量PCR仪为德国耶拿公司qTOWER产品。胰蛋白酶及TRIzol RNA提取试剂盒为Sigma公司产品。Smo单克隆抗体及S-P免疫组化染色试剂盒购自上海英骏生物科技有限公司。PCR试剂盒由QIAGEN公司提供。PCR引物由上海西唐科技有限公司代为合成。

1.3 RNA提取及实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)分析Smo mRNA表达 参照试剂盒说明提取组织中的总RNA并进行逆转录及PCR扩增反应。Smo引物∶Sense 5-ACGCACAGAGGCGACTTGA-3,antisense 5-ATCATTGGCGTCCATAGG-3。β-actin引物∶Sense 5-GTCAATGACTCGAGGCCA-3,antisense 5-TACTTCGTCGAAGCACAA-3。循环扩增条件为∶在93℃2m进行预变性；循环周期40个,顺次包括93℃60秒,55℃60秒以及72℃20秒；最后在72℃条件下延伸7m。Smo扩增产物长度为128bp。每个样品均重复检测3次。采用2△Ct法计算Smo相对表达量(△Ct=Smo Ct-β-actin Ct)[1]。

1.4 免疫组化法分析Smo蛋白分布及表达 具体操作步骤参照试剂盒说明书进行,以试剂盒自带的阳性切片的免疫组化染色结果为阳性对照,以PBS替代一抗作为阴性对照。图像分析借助CMIAS多功能真彩色图像分析系统完成。结果分析参考Yoshikawa等[2]判断方法,将细胞膜和(或)胞质内及细胞核和(或)胞质内出现黄色或棕黄色颗粒的细胞视为阳性细胞,随机选取3个高倍视野,计数阳性细胞数的百分比并赋予分值∶＜5%为阴性,赋分0；≥5%～35%为弱阳性,赋分 1；≥35%～65%为阳性,赋分2；≥65%为强阳性,赋分3。染色强度按照3个视野总得分值分为0～9分,其中分值≥4为高表达,＜4为低表达或无表达。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析,Smo表达与胃癌临床病理特征的关系采用Mann-Whitney和Kruskal-Wallis分析法。

2 结 果

2.1 Smo mRNA在胃癌及正常胃黏膜中的表达在胃癌组织及正常胃黏膜组织中Smo的相对表达水平分别为(0.01983±0.001536)和(0.00862±0.002141)(P＜0.001),胃癌组织中Smo mRNA明显高表达。

2.2 Smo蛋白在胃癌组织中的表达 Smo阳性表达主要定位于细胞的胞膜上及胞浆内；在正常胃黏膜中,只有约23%组织表达Smo,且表达强度多为弱阳性；胃癌组织中Smo表达水平明显增强,在肿瘤细胞膜上及胞浆内均可见浓染的棕黄色颗粒。在68例胃癌组织中,52例表现为Smo阳性,阳性表达率为76.5%,16例为阴性,阴性表达率为23.5%。35例胃癌标本参照设定标准表现为Smo高表达(51.5%),33例为低表达。详见表1。

2.3 Smo蛋白表达水平与临床及病理特征的关系

Smo蛋白表达水平与患者年龄、性别、肿瘤大小、组织病理学分级、组织病理学分型(WHO分型)、淋巴结侵犯以及TNM分期的关系。结果显示,Smo蛋白在胃癌组织中的表达水平与肿瘤大小(P=0.0026)、组织病理学分级(P=0.0168)、淋巴结侵犯(P=0.0251)以及TNM分期(P=0.0356)呈正相关(r 值分别为 0.423、0.387、0.542),而与性别 、年龄以及WHO分型无关。详见表1。

表1 胃癌组织中Smo蛋白表达水平与临床及病理特征的关系

3 讨 论

Sonic hedgehog是人类胚胎发育过程中调控细胞增殖和组织分化的重要信号通路之一。它主要是由细胞外分泌型信号糖蛋白Shh配体、细胞膜上跨膜蛋白受体Ptc和另一跨膜蛋白Smo组成的复合物,以及细胞浆内丝氨酸/苏氨酸激酶Fused(Fu)、Fu抑制剂(SuFu)、类运动蛋白Costal-2(Cos2)和锌指转录因子Gli蛋白(Gli1,Gli2,Gli3)组成[3_4],其中Smo蛋白是sonic hedgehog信号通路中的信息转换器,它能够将细胞外的Shh信号转换成细胞内的Gli1信号[5],对Sonic hedgehog信号通路具有激活作用。

现有研究结果表明,Sonic hedgehog信号通路存在两种激活方式∶一是配体依赖性激活方式,即因Shh配体的过度表达而引起此信号通路中目的基因的转录,从而导致肿瘤的发生和发展；二是配体非依赖性激活方式,即Smo等基因发生功能获得性突变,从而导致Sonic hedgehog信号通路的异常激活,促进肿瘤的发生和发展[6_8]。目前的研究表明,Smo基因在多数肿瘤组织,如肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌等组织中有不同程度的表达上调[9_11]。同时有学者发现,用 Smo拮抗剂 cyclopamine干预后的食管癌细胞生长减慢,凋亡增加[12]。上述现象均表明Sonic hedgehog通路激活在肿瘤发生过程中可能是一种普遍现象,并且与Smo异常表达有关。

本组结果显示,Smo基因在胃癌组织中的表达强度明显高于正常胃黏膜组织,与有关报道结果一致。免疫组织化学方法亦提示,在正常胃黏膜组织中,Smo蛋白不表达或弱表达,而在胃癌组织中Smo蛋白表达阳性率及表达强度均显著上升,明显高于正常胃黏膜,并随着肿瘤体积的增大、胃腺癌分化程度下降、淋巴结转移以及TNM分期的恶化其表达水平明显提高,从而进一步表明Smo蛋白与胃癌的发生、发展、侵袭以及转移之间存在密切关系。

本实验中的Smo蛋白表达水平与临床及病理特征关系分析结果显示,随着肿瘤的生长、侵袭能力的增强以及病期的进一步恶化,Smo蛋白表达水平明显升高,提示Smo可能与胃癌的侵袭及转移能力密切相关,Smo蛋白高表达的肿瘤可能具有更强的侵袭能力,从而严重影响患者的预后,而密切监测Smo蛋白可能对判断胃癌患者的预后提供有价值的信息。

本组结果显示,Smo蛋白阳性表达率为76.5%,高表达率为51.5%,与其他部位肿瘤组织中Smo表达率接近[9_10],提示在胃癌组织中,Som蛋白表达及通路激活方式类似于其他肿瘤组织。

综上所述,作者认为Sonic hedgehog信号通路的异常激活可能直接参与了胃癌的发生及发展过程,而Smo蛋白的高表达则可能是Sonic hedgehog信号通路异常激活的机制之一。本组结果也显示,16例Smo mRNA表达明显高于正常胃黏膜组织的胃癌标本中Smo蛋白表达为阴性,提示转录后调节机制亦参与了Smo对Sonic hedgehog信号通路的异常激活过程,但其具体调节机制仍需要进一步探讨。

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