黄澄澄 周旭春 刘文秀

（重庆医科大学附属第一医院消化内科，重庆 400016）

结直肠癌（Colorectal Carcinoma，CRC）在我国发病率列恶性肿瘤死因的第5位［1］。结直肠癌的浸润，转移及早期预防，早期诊断，早期治疗与患者的预后紧密相关。

肿瘤的上皮－间质转化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）是肿瘤细胞失去上皮细胞的特性，而转化成具有间质细胞特性的细胞。ZEB－1（zinc finger E－box－binding protein 1）是一种结合锌指蛋白，又称为TCF8、AREB6或deltaEF1，近年发现ZEB－1与多种肿瘤发生，发展有密切联系，并参与了EMT的调节过程。ZEB－1在结直肠癌中的表达情况如何，与临床病理有何联系，国内外报道较少。本研究使用免疫组织化学技术检测51例结直肠癌组织中ZEB－1的表达情况，同时联合检测Claudin1和E－cadherin的表达，并探讨三者与临床病理的联系及三者之间的关系。

材料和方法

1.临床资料

收集2011年3月至2011年12月期间重庆医科大学附属第一医院普外科行手术切除的，术后病理诊断为结直肠癌的标本51例，同时取相应的癌旁组织。全部病例术前均未接受放疗和化疗，均无炎症性肠病病史，均无长期使用非甾体类抗炎药和糖皮质激素史。病理分型及分级按WHO分类标准，分期按TNM标准。其中男30例，女21例，平均年龄61.96岁。结肠癌20例，直肠癌31例；其中粘液腺癌10例、印戒细胞癌2例、低分化腺癌7例、高和中分化腺癌32例。将高和中分化归为分化较好的低级别组；将低分化、粘液腺癌和印戒细胞癌归为分化较差的高级别组。TNM分期：Ⅰ期7人，Ⅱ期20人，Ⅲ期20人，Ⅳ期4人。有淋巴结转21人，无淋巴结转移30人。所有标本取材后经多聚甲醛固定、常规脱水、石蜡包埋、5μm连续切片。

2.材料及方法

2.1 主要试剂

Claudin1多克隆抗体 ，购于北京博奥森生物技术有限公司；ZEB－1多克隆抗体，购于美国santa cruz；E－cadherin单克隆抗体、免疫组化试剂盒及显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物有限公司。

2.2 免疫组化染色检测Claudin1、ZEB－1及E－cadherin表达情况

染色程序严格按试剂盒说明书操作。以磷酸盐缓冲液代替一抗作空白对照。切片常规脱蜡，PH9.0EDTA 微波炉加热修复抗原，3%双氧水37℃孵育15min灭活内源性过氧化物酶，正常山羊或兔血清工作液封闭30min，加Claudin1、ZEB－1及E－cadherin一抗（稀释度均为1∶100）.4℃湿盒中过夜；复温1小时，加生物素化二抗37℃孵育30min，以辣根过氧化物酶标记链酶卵白素37℃孵育30min，加DAB显微镜下显色，苏木素复染细胞核，盐酸酒精分化，碳酸锂返蓝，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。

2.3 结果判断

Claudin1的免疫组织化学阳性结果判定：每张切片随机选取5个高倍镜视野，计数100个肿瘤细胞中Claudin1阳性的细胞数积分：＜5% 为0分，5% －24%为1分，25% －50% 为2分，51% －74%为3分，≥75%为4分；阳性细胞着色度积分：无0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；两项之和0－1分为（－），2－3分为（＋），4－5分为（＋＋），6－7分为（＋＋＋）。（－/＋）为阴性表达，（＋＋/＋＋＋）为阳性表达。E－cadherin阳性结果判定：无阳性着色或阳性细胞数＜90% 为阴性表达，阳性细胞数≥90% 为阳性表达。ZEB－1阳性结果判定：参考文献［2］将核阳性着色的肿瘤细胞和非间质细胞计为阳性细胞，按着色度积分：无0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；≥1分计为阳性，＜1分计为阴性。

3.统计学方法

使用SPSS17.0软件进行统计，免疫组化结果进行卡方检验，使用连续性校正公式或Fisher精确检验计算χ2值，并进行spearman相关性分析，检验水准α＝0.05.

结 果

1.免疫组化染色检测 Claudin1、ZEB－1和 E－cadherin表达情况

结直肠癌组织中Claudin1主要为细胞质表达，未见细胞核表达.而癌旁组织中Claudin1主要为细胞膜表达（图1、2）。Claudin1阳性率肿瘤组织（68.62%）高于癌旁组织（37.25%），差异具有统计学意义（P＜0.01）。ZEB－1主要为肿瘤间质细胞核、肿瘤细胞核表达，部分肿瘤组织可见细胞质阳性着色（图5、6、7），ZEB－1阳性率肿瘤组织（23.53%）高于癌旁组织（0），差异具有统计学意义（P＜0.01）。E－cadherin主要为细胞膜表达（图3、4），E－cadherin阳性率肿瘤组织（56.86%）低于癌旁组织（98.0%），差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.Claudin1、ZEB－1和 E－cadherin蛋白在结直肠癌中的表达与患者临床病理联系

Claudin1和ZEB－1的表达随着结直肠癌TNM分期的增加逐渐增加，Claudin1及ZEB－1的表达率在III－IV期组（87.5%、41.7%）高于I－II期组（51.9%、7.4%），差异具有统计学意义（P＝0.008，P＝0.007）；有淋巴结转移组（90.9%、45.5%）高于无淋巴结转移组（51.7%、6.9%），差异具有统计学意义（P＝0.005，P＝0.002）。ZEB－1表达率在高级别组（42.1%）高于低级别组（12.5%），差异具有统计学意义（P＝0.037）。E－cadherin的表达率在I－II期组（74.1%）高于III－IV期组（37.5%），差异具有统计学意义（P＝0.019）；无淋巴结转移组（72.4%）高于有淋巴结转移组（36.4%），差异具有统计学意义（P＝0.022）。而Claudin1和E－cadherin的表达率与肿瘤的分级程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Claudin1，ZEB－1和E－cadherin的表达率与患者的年龄，性别，肿瘤发生部位及肿瘤大小等比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

3.结直肠癌中 Claudin1、ZEB1和 E－cadherin相关性分析

Claudin1、ZEB1和E－cadherin在结肠癌中的表达经过Spearman相关分析，Claudin1与E－cadherin的表达，及ZEB－1与E－cadherin的表达均呈负相关，相关系数r＝－0.302，r＝－0.357（P＝0.032，P＝0.01）。而Claudin1与ZEB－1的表达呈正相关，相关系数r＝0.358（P＝0.01，见表2）。

表1 结直肠癌中Claudin1、ZEB－1和E－cadherin蛋白表达与临床病理特征的关系Table1 The expression and clinical pathological significance of Claudin1，ZEB－1and E－cadherin in colorectal cancer

表2 大肠癌组织中Claudin1、ZEB－1和E－cadherin表达之间的关系Table2 The relationship of Claudin1、ZEB－1and E－cadherin expression in Colorectal Cancer

讨 论

Claudins家族蛋白分子量在20－27kDa，该家族分子都存在四个疏水跨膜区域，在细胞外形成两个外环，C末端在细胞内与闭锁小带蛋白（ZO－1，ZO－2，ZO－3）连接，相邻细胞间2个外环相连，细胞被此种结构分成顶侧区和基侧区，具有栅栏屏障功能，对身体内环境的稳定起着重要作用。人们认识较多的是Claudin1，有研究发现Claudin1的异常表达与肝癌，骨肉瘤和黑色素瘤等肿瘤的浸润和转移密切相关［3］。本研究中发现Claudin1在肿瘤组织的的表达率（68.62%）高于癌旁的表达率（37.25%），差异具有显著性。Claudin1在肿瘤组织中主要是细胞质表达，与文献报道相似［4］。但本研究Claudin1在结直肠癌细胞核未见表达与Dhawan研究Claudin1在结直肠癌细胞核表达也有增加略有差异［5］，原因可能是样本量较小或是选用的试剂厂家差别造成的。随肿瘤分期的增加Claudin1的表达率增加，有淋巴结转移组表达率高于无淋巴结转移组，差异具有显著性。Claudin1的异常表达，可能导致细胞间紧密连接结构的破坏和重组，细胞失去极性，渗透性增加，利于营养物质运输，促进肿瘤的生长及迁移。E－cadherin做为一种抑制肿瘤细胞浸润转移的蛋白，E－cadherin表达降低是上皮间质转化的标志。本研究发现，在51例癌旁组织中，E－cadherin主要位于细胞膜上，表达率为98%，而在肿瘤组织中E－cadherin的表达率降低，为56.86%，且其表达率随着结直肠癌的分期增加而减少，有淋巴结转移组表达率低于无淋巴结转移组。有学者发现，在SW480结肠癌细胞中，Claudin1表达升高可以导致细胞膜上E－cadherin表达降低，通过沉默SW620结肠癌细胞中Claudin1的基因，可导致E－cadherin基因的启动子区域活性增加2.5－6倍，增加 E－cadherin mRNA 水平［5］。本研究进一步在蛋白质水平研究发现，Claudin1与E－cadherin呈负相关关系，提示Claudin1的异常表达、E－cadherin水平降低与结直肠癌的生物学行为有关。

snail超家族包括snail、slug、ZEB－1、ZEB－2等，锌指E盒结合蛋白1（ZEB－1）是其中一员，基因位于人类10号染色体短臂上，含有两个锌指结构簇及一个同源结构域。近年来研究发现在某些肿瘤中，如乳腺癌，骨肉瘤，胃癌中，ZEB－1做为一种转录抑制因子，在肿瘤细胞的EMT转换中起了重要作用，ZEB－1可能增加肿瘤细胞的迁移能力［6－9］。在结肠癌研究中发现，转录抑制因子ZEB1可促进结肠癌细胞的迁移，失去上皮细胞极性因子，即幼虫巨大致死性基因2（Lethal giant larvae 2，LGL2），使细胞失去极性［10］。在肺腺癌细胞中的研究发现，经过慢病毒敲除ZEB－1可在体内和体外抑制肿瘤细胞的生长［11］。ZEB－1在细胞的定位，文献报道有差异。有研究发现，在非小细胞肺癌组织中，ZEB－1主要表达于腺癌细胞核和细胞质中［11］；而在膀胱癌组织中，ZEB－1主要表达于肿瘤组织上皮细胞核及间质细胞核中［12］；还有研究发现，在乳腺癌组织中，肿瘤上皮细胞不表达ZEB－1，只表达于间质细胞中［13］。本研究发现，ZEB－1主要表达于肿瘤的间质细胞核和肿瘤细胞核中，部分表达于肿瘤细胞胞质中。本研究参考文献［2］将核阳性着色的肿瘤细胞和非间质细胞计为阳性细胞。ZEB－1在肿瘤组织的表达率（23.53%），明显高于癌旁组织，在III－IV期组高于I－II期组，并且ZEB－1表达率在有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，提示ZEB－1可能参与了肿瘤细胞的迁移过程。Aigner研究发现，ZEB－1在肿瘤的浸润前沿表达增多，并可抑制肿瘤细胞的分化［14］。本研究显示，ZEB－1的表达率与结直肠癌的分化程度相关，ZEB－1的表达率随着结直肠癌组织的分化程度的降低而增加，表明ZEB－1可能参与了肿瘤细胞的去分化过程。该结果与Aigner的研究存在某种程度上的一致性。ZEB－1的表达率与患者的性别，年龄，肿瘤的大小及肿瘤组织的部位比较，差异无统计学意义。ZEB－1可能抑制 E－cadherin的表达，ZEB－1的侧翼锌指E族可以与E－cadherin启动子序列上的E盒序列的 DNA（CACCT/G）结合［15］，阻止其启动，降低E－cadherin的转录。在胰腺癌细胞研究中发现，ZEB－1可通过募集组蛋白脱乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）于 E－cadherin启动子上，而抑制E－cadherin转录［16］。Joo JH 等认为，ZEB－1可通过结合依赖和非结合依赖的作用，与C区结合蛋白（C－terminal Binding Protein.CtBP）形成复合体，在CtBP存在的情况下，可抑制E－cadherin的表达［17］。本研究发现，ZEB－1的表达与 E－cadherin的表达在蛋白水平上呈负相关关系，ZEB－1可能抑制E－cadherin的表达，导致上皮间连接破坏，从而肿瘤细胞更易迁移。

目前，对 Claudin1、ZEB－1及，E－cadherin在结直肠癌的浸润，转移中的相互关系研究较少。有学者使用荧光素追踪发现，在转染Claudin1的细胞中，ZEB－1启动子活性增加4－5倍。在SW480和SW620结肠癌细胞系中，发现增加Claudin1的表达可引起ZEB－1的增加，E－cadherin的减少，而不影响snail1和snail2的表达，使用选择性抑制剂阻止Akt的磷酸化或使β－catenin发生突变而降低wnt通路的活性，都可降低Claudin1对ZEB－1的调节［18］，因而推测Claudin1的表达增加通过wnt通路或PI－3K通路，使得ZEB－1的表达增加，从而减少了 E－cadherin的合成，即存在 Claudin1/ZEB－1/E－cadherin轴［18］。本研究发现，从体内研究，在蛋白质水平上发现，ZEB－1与Claudin1呈正相关关系，Claudin1、ZEB－1与 E－cadherin呈负相关关系，本实验研究结果与前人的体外研究结果相似。Claudin1和E－cadherin的细胞膜表达量减少可能降低肿瘤细胞间的粘附力，使肿瘤细胞失去上皮细胞极性，导致肿瘤细胞的上皮间质转化（EMT），使肿瘤细胞更容易浸润和转移。Claudin1、ZEB－1、E－cadherin三者之间协同作用，有利于肿瘤细胞的浸润和转移，与肿瘤的预后有关。三者的联合检测将有利于临床上预测患者的预后并为结肠癌的基因治疗提供新的方法和策略，值得进一步研究。

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