夏亚穆,杜康健,夏 军(青岛科技大学化工学院,山东青岛266042)

由乳酸菌制备维生素B类化合物的研究进展

夏亚穆,杜康健,夏 军
(青岛科技大学化工学院,山东青岛266042)

维生素B类化合物是人体必需物质,主要通过外源性的食物或药物来补充。选育得到的乳酸菌能产生天然的人体易于吸收的不同类型维生素B。介绍了近年来通过乳酸菌生物合成维生素B类化合物的研究进展,为进一步研究产维生素B类化合物乳酸菌菌种选育和代谢工程改造提供参考。

乳酸菌;维生素B类化合物;代谢工程

1 前言

维生素B类化合物是人体正常代谢的必需物质,大部分不能由人体自身产生,很多人由于膳食营养不平衡、吸收效率低而导致维生素B缺乏进而引起疾病,须通过外源性的维生素B营养食品或者药物来补充。目前,维生素B类化合物的工业化生产方法主要有微生物发酵法和化学合成法[1,2],其中化学合成法路线设计复杂、副产品多、难以提纯,而微生物发酵法成本低廉、生产工艺简单、环境友好,尤其是利用乳酸菌合成维生素B类化合物的方法具有广阔的发展空间和应用前景,已成为研究的热点。

乳酸菌是发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称,其成分相当庞杂,目前至少可分为18个属,共有200多种[3]。许多乳酸菌发酵能产生维生素B类化合物,而且不同的菌种能够选择性产生不同种类的维生素B。作者在此介绍了近年来由乳酸菌制备维生素B2、B9、B12及其它B族维生素的研究进展。

2 由乳酸菌制备维生素B类化合物

2.1 由乳酸菌制备维生素B2

维生素B2又称核黄素,在细胞代谢中发挥着重要的作用。核黄素缺乏会导致口腔、唇等部位的炎症和机能障碍。核黄素存在于奶制品和动物肝脏等食物中,通常以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅酶形式和蛋白质结合存在,人体对其生物利用度远低于游离态核黄素[4],而乳酸菌发酵产生的核黄素大部分是游离态,因此,通过选育产核黄素乳酸菌菌株并将其用于发酵食物,可有效解决人体每天摄入核黄素不足的问题。

Capozzi等[5]利用自发抗玫瑰黄色素突变体选择法从小麦面粉中筛选到了乳酸菌,分离出2种能够产生大量维生素B2的植物乳酸杆菌菌株。将筛选得到的菌株用于面包制作,高效液相色谱分析结果表明面包中核黄素的含量增加了3倍。

Jayashree等[6]从印度韦洛尔地区的几种奶制品中筛选出48株菌株,其中乳酸杆菌MTCC8711发酵后能产生大量核黄素,在培养基中培养24 h可生成2.29 mg·L-1的核黄素。该菌株通过改造,有望成为发酵食品产业中一种很好的发酵剂来提高食品中核黄素的产量。

利用代谢工程技术是获得产核黄素乳酸菌菌株的另一条途径。Burgess等[7]以雷特氏乳酸球菌亚种NZ9000为对象,对其中的rib操纵子进行基因互补实验和缺失分析实验以考察其各个部分在生物合成过程中的作用,然后通过基因特异性实验来检测rib操纵子中哪些基因过表达后可以提高核黄素产量。结果表明,当乳酸菌的ribG、rib H、ribB、ribA 4种基因全表达时,其发酵产物中核黄素的含量很高,达到24 mg· L-1。

基因工程技术的一个重要优势是能够获得稳定遗传并拥有多种功能的菌株。Sybesma等[8]以雷特氏乳酸球菌亚种NZ9000为对象,经过基因突变选育使其由核黄素消耗菌株转变为核黄素生产菌株,基因分析发现这是因控制核黄素合成基因的上游调控区中有一对碱基发生变化导致的;同时,增加乳酸菌中GTP环水解酶Ⅰ(叶酸生物合成途径中的关键酶之一)的量,发酵产物中叶酸含量提高。

2.2 由乳酸菌制备维生素B9

维生素B9又称叶酸,是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。人类缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少等多种疾病,孕妇对叶酸的需求量比正常人高4倍,当叶酸缺乏时,可导致胎儿体重低、唇腭裂、心脏缺陷等。现代研究发现,通过选育产叶酸乳酸菌菌株,并将其用于发酵食品,可满足人体对叶酸的需求。

LeBlanc等[9]研究发现,乳酸乳球菌和嗜热链球菌能够大量产生叶酸,嗜酸性乳酸杆菌和植物乳酸杆菌等也能产生叶酸;Santos等[10]研究发现,经过代谢工程改造的罗伊氏乳酸杆菌JCM1112能产生大量叶酸。刘友群等[11]对嗜酸性乳酸杆菌及乳酸乳球菌发酵合成叶酸的影响因素进行了研究。结果表明,乳酸菌代谢合成叶酸的产率为17～100μg·L-1,菌种、培养时间、p H值、对氨基苯甲酸(PABA)质量浓度均会影响乳酸菌合成叶酸的产量。与乳酸乳球菌亚种相比,嗜酸性乳酸杆菌CH-2的叶酸产量更高;在培养基中加入PABA可加快叶酸的合成,提高发酵液中叶酸的含量。

研究表明,在蔬菜发酵过程中通过选择合适的乳酸菌作发酵剂也能够得到大量的5-甲基四氢叶酸[12]。在10种不同的乳酸菌培养基中,其中一种培养基能得到原来2倍量的叶酸,这些叶酸是天然的,生物利用度高。

Pompei等[13]选取76株乳酸菌类的双歧杆菌,在无叶酸的半合成的培养基SM7中分别培养,结果发现其中17株菌株不需叶酸就能生长,有6株可以产生较多的叶酸(41～82 ng·m L-1)。

在乳酸乳球菌[14]、植物乳酸杆菌[15]和德氏乳酸杆菌保加利亚变种[16]中控制叶酸生物合成的基因已经被鉴定。但并非每种乳酸杆菌属都能够产生叶酸,如加氏乳酸杆菌[17]、唾液乳酸杆菌[18]、约氏乳酸杆菌[16]等。

Hugenholtz等[19]研究发现,乳酸菌释放到体外的叶酸的量和其体内单谷酰叶酸与多谷酰叶酸的比例有关。通过从人体或老鼠体内获得能表达γ-谷酰基水解酶的基因片段,在Nisin调控表达系统(NICE System)中进行互补DNA克隆,然后引入到乳酸乳球菌中表达,使多谷酰叶酸水解成单谷酰叶酸,从而使乳酸菌释放更多叶酸。

利用代谢工程技术可以提高乳酸乳杆菌[14,20]、格氏乳酸杆菌[17]和罗伊氏乳酸杆菌[10]的叶酸产量。通过控制乳酸杆菌中fol KE基因的超表达来编码6-羟甲基-二氢嘌呤焦磷酸激酶(fol K)和GTP环水解酶(folE)可使细胞外叶酸产量提高10倍,总叶酸产量提高3倍;与此同时,fol A基因超表达的二氢叶酸还原酶可使叶酸总产量下降50%。除此之外,已经检测到fol KE和fol C超表达的结合有利于胞内叶酸的积累[21]。另外,GTP环水解酶的超表达可能具有提高叶酸产量的潜力。总之,fol KE超表达与其它叶酸生物合成基因表达的适当结合能够显著提高叶酸的产量,并且这些基因修饰的乳酸菌和天然菌株一样安全[22]。

Wegkamp等[17]将消耗叶酸的格氏乳酸杆菌ATCC33323改造成了高效的叶酸生产菌株。在该菌株中,除了fol A和fol C基因外不存在其它叶酸生物合成基因,而fol A和fol C基因参与了从外界中摄取叶酸的再生和保留。将乳酸乳球菌MG1363中含有完整叶酸基因簇(fol A、fol B、fol KE、fol P、ylgG和fol C)的质粒引进到格氏乳酸杆菌ATCC33323中,经过重组的菌株即转变成叶酸生产菌株。

乳酸菌发酵得到的天然叶酸与化学合成的叶酸相比,不会掩盖由维生素B12缺乏而导致神经系统受损所引起的病症[23]。这就使得选育高产叶酸的乳酸菌菌株、提高发酵食物中叶酸含量的研究更有意义。

2.3 由乳酸菌制备维生素B12

维生素B12是所有呈现氰钴胺素生物活性的类咕啉的总称。人体如缺乏维生素B12会引起造血系统、神经系统、心血管系统疾病。目前,维生素B12主要是由费氏丙酸杆菌、脱氮假单胞菌等微生物合成得到,但生产成本高、价格昂贵,因此进一步研究、选育优良的产维生素B12菌株,对降低维生素B12生产成本十分重要。

一些乳酸菌发酵产物中含有维生素B12。Taranto等[24]研究表明,乳酸菌中罗伊氏乳酸杆菌CRL1098在无维生素B12培养基中可以利用甘油合成1,3-丙二醇,而此代谢过程中必定会有维生素B12作为辅酶参与反应,这就证明乳酸菌类微生物可以生成维生素B12。对罗伊氏乳酸杆菌CRL1098胞内提取物的色谱分析证实,该菌株可产生类似维生素B12的复合物,该复合物的吸收光谱除洗脱时间不同外,其它特征均与维生素B12极其相似。Santos等[10,25]发现罗伊氏乳酸杆菌DCM20016、JCM1112、CRL1324和CRL1327也能够产生一些类咕啉物质。Molina等[26]研究表明:罗伊氏乳酸杆菌CRL1098产生的维生素B12类似物具有生物活性,可以有效避免由于缺乏维生素B12而引起的病症。上述研究表明罗伊氏乳酸杆菌可能含有合成维生素B12的基因。Santos等[27]通过表达和钝化编码PocR蛋白的基因而证实此蛋白就是控制维生素B12合成的关键。

Madhu等[28]利用从印度食物Kanjikad中提取的植物乳酸杆菌细胞内合成维生素B12,经96 h的深层发酵得到维生素B1213 ng·(g培养基干重)-1;用氰化钠细胞裂解液溶解细胞,再用苄醇-氯仿-水体系进行萃取,即可提取出细胞内的维生素B12。

利用基因突变和基因工程技术[29,30]可有效提高费氏丙酸杆菌的维生素B12产量,但针对乳酸杆菌的类似研究还未开展过。了解产维生素B12的乳酸菌的复合基因序列将有助于设计相应的策略用于选育高产维生素B12的优化菌株[31,32]。

2.4 由乳酸菌制备其它B族维生素

乳酸菌除了能制备维生素B2、B9和B12外,还能制备其它B族维生素,但相关研究的报道较少[33,34]。

乳酸菌中双歧杆菌使得豆奶中维生素B1的含量提高了11%[35]。利用嗜热链球菌ST5和瑞士乳酸杆菌R0052或长双歧杆菌R0175发酵大豆,维生素B1和B6的含量均得以提高[36]。这是首次利用纯的瑞士乳酸杆菌和嗜热链球菌培养基来研究发酵饮料中维生素B1和B6的含量。

3 结语

通过对乳酸菌类微生物菌种和培养条件的共同选择可提高发酵食品中不同维生素B类化合物的含量、改善食品的品质,获得良好的经济效益。随着乳酸菌基因测序和新型工程技术的发展,利用价廉易得的乳酸菌菌株制备富含维生素B类化合物产品的潜力很大。

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Research Progress of B-Group Vitamins Produced by Lactic Acid Bacteria

XIA Ya-mu,DU Kang-jian,XIA Jun
(College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China)

B-Group vitamins are a group of human essential substances that play important roles in cell metabolism.They can be externally obtained from food and medicine.Most lactic acid bacteria(LAB)can produce B-group vitamins which are natural,various and easy to be absorbed in human body.This review shows current research progress of B-group vitamins produced by LAB.It provides some references for the study of screening LAB strains and for the improvement of the metabolic engineering.

lactic acid bacteria;B-group vitamins;metabolic engineering

TQ 924

A

1672-5425(2012)11-0005-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2012.11.002

山东省自然科学基金资助项目(ZR2010HM023),高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20093719120004)

2012-07-16

夏亚穆(1974-),男,甘肃天水人,副教授,主要从事生物活性物质的提取、分离、合成等研究与开发工作,E-mail:xiayamu @qust.edu.cn。