于丽娟，丁 斐，叶 辉*

（南通大学 生命科学学院，江苏 南通 226019）

麦曲作为黄酒发酵的糖化剂，含有大量能分泌淀粉糖化酶的微生物[1]，糖化酶能将淀粉水解为葡萄糖，进而被微生物发酵，生产酒精。糖化酶活力高，原料利用率就高，因此筛选高产糖化酶菌株对酿酒工业具有重要意义。本研究从不同麦曲中分离筛选高产淀粉糖化酶菌株，依据形态特征和ITS序列分析对筛选菌株进行鉴定，并研究了粗酶的酶学特性。

1 材料与方法

1.1 培养基

斜面培养基：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，水1000mL，琼脂20g，自然pH值，121℃湿热灭菌20min。

选择性平板培养基（产透明圈）：可溶性淀粉2g，蛋白胨0.5g，琼脂20g，氯化钙0.4g，磷酸氢二钠0.8g，自然pH值；水1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。

固体发酵基础培养基[2]：麸皮8g，玉米粉1g，大豆粉1g，盐溶液10mL，121℃高压蒸汽灭菌20min（盐溶液：K2HPO42%，（NH4）2SO44%）。

1.2 菌株筛选

初筛：取粉碎好的麦曲10g，装入带玻璃珠的90mL无菌水的三角瓶中，摇晃打散，使麦曲中的微生物形成悬浮液，用无菌移液管对悬浮液进行稀释，稀释至10-1～10-6。吸取各种稀释度溶液0.1mL涂布于选择性培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养3d，取出培养皿，滴加卢戈氏碘液，测量透明圈直径D和菌株直径d。挑取D/d较大的菌株接种斜面保藏。

复筛：无菌水洗出孢子，用血球计数板调整孢子浓度，接种于固体培养基中。混匀后，30℃培养72h，培养期间每隔一段时间摇动一次。培养结束后，加入50mL蒸馏水并将固体培养基捣碎，40℃水浴1h，取出粗酶液8000r/min离心5min，弃沉淀得粗酶液，测定淀粉糖化酶活力。

淀粉糖化酶活力测定采用碘量法[3]。酶活力单位定义为1mL酶液，于40℃、pH 4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，以U/g（U/mL）表示。

1.3 菌株DNA的提取及PCR扩增

采用北京索莱宝科技有限公司的真菌基因组提取试剂盒提取纯株真菌的基因组DNA。1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR扩增参照方华等[4-5]的方法。

1.4 酶学特性研究

1.4.1 反应温度对酶活性的影响以及酶的热稳定性研究

在自然pH值条件下，将酶液和淀粉混合液分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴锅中水解30min，测定酶活力，考察温度对酶活的影响。将酶液分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴锅中加热30min，然后再加入淀粉溶液，在40℃测定残余酶活力，考察温度稳定性。每组重复3次，取平均值。

1.4.2 反应pH值对酶活性的影响以及酶的pH值稳定性

配制pH值不同的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0，在40℃分别测定酶活力，考察pH值对酶活的影响。将酶液置于不同pH值的缓冲液中30min，然后再加入淀粉溶液，40℃酶解30min，测定酶活。每组重复3次，取平均值。

1.4.3 金属离子对淀粉酶活性的影响

在反应体系中分别加入1mL浓度为1mmol/L的各种金属离子，研究金属离子对淀粉酶活性的影响。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

滴加卢戈氏碘液后，静置30min。观察培养皿中有无透明圈，若有，测量菌株直径d和透明圈直径D，挑选D/d较大的菌株进行复筛。复筛结果见表1，其中菌株A17糖化酶活力最高。

2.2 菌株A17的形态特征

菌株A17的菌落形态和镜检形态见图1。

A17的菌落形态：菌落生长快，10d直径达5cm～6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。在含0.05%茴香醛的察氏培养基上，分生孢子呈现红色。

表1 菌株复筛结果Table 1 Strains rescreening results

图1 菌株A17的形态Fig.1 The morphological observation of strain A17

A17的镜检形态：分生孢子头放射状，直径150μm～300μm。分生孢子梗2mm左右，无隔膜。顶囊近球形，分生孢子卵圆形或近球形。

2.3 菌株A17的ITS（internal transcribed spacer）序列PCR扩增结果分析

图2 菌株A17的系统发育树分析（数字表示与相邻菌属的同源性百分数）Fig.2 Phylogenic tree of strain A17 and related species based on ITS sequences (Bootstrap values were indicated as percentage to all branches)

将菌株A17的ITS序列结果通过Blast程序与Genbank中核酸数据进行比对分析，构建系统发育树见图2。结果表明，菌株A17的ITS序列和曲霉菌的结构相似，结合其形态特性（图1）和ITS序列比对结果，初步鉴定菌株A17为米曲霉。

2.4 酶学特性研究

2.4.1 温度对酶活力的影响及酶的热稳定性

温度对酶活力及酶热稳定性的影响见图3。在30℃～60℃时，随着温度升高，酶活力逐渐增大，60℃后，该酶蛋白由于高温部分失活，活力下降，因此，该酶的最适温度为60℃。由酶的热稳定性曲线可知，酶在30℃～55℃较稳定，相对酶活力保持在80%以上，当温度升高为60℃时酶活迅速下降为40%左右，因此，该酶的热稳定范围为30℃～55℃。

图3 温度对酶活力及酶稳定性的影响Fig.3 Effect of temperature on the enzyme activity and stability

2.4.2 pH值对酶活力的影响及酶的pH值稳定性

pH值对酶活力的影响及酶的pH值稳定性见图4。由图4可知，该酶在pH 3～7都具有较高的活力，pH4.0时达最大，因此，该糖化酶的最适pH值为4.0，为一酸性淀粉糖化酶。酶液在不同pH值缓冲溶液中处理30min后，在pH 4～5之间比较稳定，保持80%以上的酶活性。

图4 pH值对酶活力及酶稳定性的影响Fig.4 Effect of pH value on the enzyme activity and stability

2.4.3 金属离子对淀粉酶活性的影响

各金属离子对酶活力的影响见表2。Mg2+、Ca2+对该酶有一定的激活作用，Fe3+、Mn2+、Cu2+对该酶有较强的抑制作用。

表2 不同金属离子对酶活性的影响Table 2 The effect of different metal ions on the enzyme activity

3 结论

糖化酶的应用范围日益扩大，特别是在食品生产行业中得到了广泛的应用。如糖化酶的应用使粮醅入酵后发酵升温快、幅度大，提高原料的出酒率，可缩短发酵周期[6-7]；在食用醋生产中，应用糖化酶可以解决企业自制酒母质量不稳定和夏季高温等生产难题，使食用醋生产正常进行[14]。本研究以透明圈平板初筛，固态发酵测酶活复筛的方法从黄酒麦曲中筛选到一株产糖化酶活力较高的菌株A17，经鉴定为米曲霉。将菌株A17进行固态发酵后，酶活力可达1835U/g干曲。对该酶酶学性质的初步研究表明，该酶的最适作用温度为60℃，最适作用pH 值为4，Ca2+、Mg2+对酶有一定的激活作用，而其他Fe3+、Mn2+、Cu2+有较强的抑制作用。该酶与其他中温酸性淀粉酶比较，具有温度耐受性好、耐酸性、产酶能力高的优势，是一种典型的中温酸性淀粉酶，具有较大的开发潜力和应用前景。

[1]汪建国.传统麦曲在黄酒酿造中的作用和特色[J].中国酿造，2004（10）：29-31.

[2]钟 浩.黑曲霉固态发酵产糖化酶的研究[J].中国酿造，2009（1）：26-29.

[3]方 华.绍兴黄酒麦曲中微生物的初步研究[D].无锡：江南大学硕士学位论文，2006.

[4]方华曹，陆 健，谢广发.黄酒麦曲中主要霉菌的分子鉴定及分类[J].酿酒科技，2006（3）：45-47.

[5]白树猛，田 黎.ITS 序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用[J].畜牧与饲料科学，2009，30（1）：52-53.

[6]彭 燕.活性干酵母辅以糖化酶在混蒸混烧工艺中的试用[J].酿酒，2006，33（3）：78-80.

[7]赵金松，罗惠波，吴士业.糖化酶在清香型小曲酒生产中的应用[J].食品科技，2006（3）：94-95.