徐先栋,谢珍玉,欧阳吉隆,王世锋,周永灿

(1.海南大学 海洋学院,海南 海口 570228;2.海南大学 海洋生物实验教学示范中心,海南 海口 570228;3.海南大学 海南省热带水生生物技术重点实验室,海南 海口 570228;4.江西省水产科学研究所,江西 南昌 330039)

石斑鱼(Epinephelus)属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲈形目(Perciformes)、科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephelus)的种类[1]。其肉质鲜美,价格昂贵,是海南等中国南方地区主要的海水养殖鱼类之一。随着石斑鱼养殖的发展,其病害问题也日益突出,目前国内外报道较多的主要包括赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)[2-3]、点带石斑鱼(E.malabaricus)[4-5]和斜带石斑鱼(E.coioides)[6-7]等石斑鱼疾病,对这些种类的养殖造成了严重威胁。褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)俗称老虎斑,是海南近年来新增的且已成为当前深受欢迎的石斑鱼养殖品种,有关其病害鲜见报道。2008年6月,在海南陵水新村港某海水鱼类网箱养殖场发生了褐点石斑鱼爆发性死亡,该病发病急、传播快、死亡率高、危害大。从初次出现发病症状到死亡高峰只要2～3 d,最高死亡率可达 90%以上。病鱼主要症状为身体两侧的鳞片脱落,当地渔民因此称之为“脱鳞病”;此外,还伴有局部体表溃疡以及烂尾和烂鳍等症状(图1)。剖开腹腔可见胆囊破裂,胆汁浸染体腔,肝脾肿大,腹腔有淡黄色腹水(图2)。作者对引起该病的病原进行了研究,以期为该病的控制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

患病褐点石斑鱼取自海南陵水新村港某网箱养殖场,为具有典型患病症状的濒死个体。病鱼体长为12～14cm,体质量30～35 g。感染试验用褐点石斑鱼购自海南文昌某石斑鱼养殖场,选择活力好、无患病史、体长 12～14cm、体质量30～36 g(平均32.5 g)的健康个体,暂养7 d后用于相关试验。

哈氏弧菌(Vibrio harveyi)标准菌株由泰国渔业部宋卡滨海水产动物健康研究所 Jirapora Kassornchaada博士惠赠。

图1 脱鳞病褐点石斑鱼外部症状Fig.1 The external symptom of E.fuscoguttatus with scale-peeled syndrome disease

图2 脱鳞病褐点石斑鱼内部症状Fig.2 The internal symptom of E.fuscoguttatus with scale-peeled syndrome disease

1.2 细菌分离

从体表溃疡、肝脏、肾脏和脾脏等部位取样,接种于2216E海水平板和TCBS平板[8],28℃培养24 h后记录结果。挑取优势菌以 2216E海水平板纯化 2次后,斜面保存备用。同时将优势菌株培养液与等体积80%甘油混合,于-80℃冰箱中长期保存备用。

1.3 病原菌确定

健康褐点石斑鱼暂养7 d后,分组饲养于45cm ×35cm × 40cm(长×宽×高)的水族箱中,每箱 5 尾。每天正常投喂石斑鱼人工配合饲料,日换水量为水体的1/3。将从患病褐点石斑鱼中分离的优势菌株经扩大培养,用无菌生理盐水配制1.1×106CFU/mL 的菌悬液,腹腔注射接种健康褐点石斑鱼,接种量 0.2 mL/尾,对照组腹腔注射等量无菌生理盐水,每组 5尾并各设置1个重复。记录感染后15 d内各组石斑鱼的发病及死亡情况,并从感染患病个体进行细菌分离,根据柯赫法则确定病原菌。

1.4 病原菌的菌种鉴定

1.4.1 表型鉴定

病原菌经进一步纯化后,参照 Mercedes-Anicel方法[9]和东秀珠等[10]的方法进行形态学和生理生化检测鉴定。生化鉴定管及相关试剂均购自杭州微生物有限公司。

1.4.2 16S rDNA序列测定与分析

病原菌经振荡培养24 h后,参照《分子克隆实验指南》(第3版)[11]的方法提取细菌总 DNA,对病原菌的16S rDNA序列的PCR扩增与测序：

正向引物 Pf：5’- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’

反向引物 Pr：5’- GGT TAC CTT GTT ACG ACT-3’

扩增目的片段大小约为1.5 kb。

PCR 反应体系(50 μL)：ExTaqDNA 聚合酶 (5 U/μL,含 Mg2+)0.3 μL,dNTP 4 μL,10 × PCR 缓冲液5 μL,正向引物 Pf(10 μmol/L)1 μL,反向引物 Pr(10 μmol/L)1 μL,DNA模板 2 μL,加超纯水至总体积 50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min;94 ℃变性1 min、57 ℃退火 1 min、72 ℃延伸 90 s,30个循环;最后于72 ℃温育10 min。1%琼脂糖电泳观察结果。采用大连宝生物(Takara)公司的 DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收。连接pMD19-T Vector,筛选阳性克隆送Takara公司进行核苷酸序列测定。采用MEGA 4.1软件将待检菌株的16S rDNA序列与从GenBank中获得的同源性最高的细菌16S rDNA 序列进行多序列匹配排列,构建系统进化树。

1.5 病原菌对褐点石斑鱼LD50值测定

病原菌经2216E液体培养基28 ℃扩大培养24 h后,离心分离细菌并以无菌生理盐水制备以下 5种浓度的菌悬液：2.4 × 103、2.4 × 104、2.4 × 105、2.4 ×106、2.4 × 107CFU/mL。试验共分6组,每组设置一个重复;其中5组为感染组,各感染组依次分别以腹腔注射接种上述菌液;对照组腹腔注射无菌生理盐水。每组接种5尾,接种量0.2 mL/尾。连续15 d观察记录各组石斑鱼发病和死亡数量,测定致病菌株对健康褐点石斑鱼的LD50值[12]。

1.6 药敏试验

选取杭州微生物有限公司生产的 25种药敏纸片,分别检测抑菌圈直径,参照抗菌药物敏感试验标准[13]确定各种药物对病原菌株的敏感性。

2 结果

2.1 细菌分离

细菌分离结果表明,从病鱼的肝脏、脾脏和肾脏都分离到大量的细菌,并且,所分离细菌的菌落形态一致：圆形、表面光滑、半透明,经24 h培养的菌落直径约1 mm。TCBS培养24 h的菌落呈黄色,直径约1 mm。从病灶处也分离到大量细菌,其中大部分菌落的形态与从肝脏等部位分离的细菌相同,夹杂有少量其他形态的菌落。分别挑取从病鱼肝、脾、肾组织分离的 3株细菌,分别命名为 XC08061、XC08062、XC08063。

2.2 病原菌确定

以 1.1 × 106CFU/mL 的 XC08061、XC08062和XC08063菌液分别对30 ～ 35 g的健康褐点石斑鱼进行人工感染,结果表明(表1)：所有 3株菌株均可使感染石斑鱼致病,感染后3 d以内的死亡率70%以上,其中菌株XC08061的感染死亡率达100%。3 d内未死亡的个体,至15 d内也不再死亡。人工感染1 d内死亡的个体,其腹腔内有淡黄色积液、体侧有局部鳞片脱落现象;感染后2 d内死亡的个体鳞片脱落和腹水的症状更加明显。从人工感染患病个体的肝脏、脾脏和肾脏也分离到大量与感染菌株菌落形态相同的细菌。根据科赫法则,判定上述三株细菌均为褐点石斑鱼脱鳞病的病原菌。

表1 3株细菌对斜带石斑鱼的感染结果Tab.1 The artificial infection results of healthy E.fuscoguttatus by three bacterial strains isolated from E.fuscoguttatus with scale-peeled syndrome disease

2.3 病原菌的鉴定

2.3.1 表型鉴定

对菌株 XC08061、XC08062和 XC08063的形态和生理生化特征鉴定结果表明(表2),3株细菌的生化特征非常接近,只有40℃生长、L-阿拉伯糖及蔗糖利用三指标存在差别：具体为：菌株 XC08062在40℃下能够生长、蔗糖利用为阴性,其余2株细菌在40℃下不生长,蔗糖利用为阳性;菌株XC08061的L-阿拉伯糖试验呈阳性,其余2株细菌为阴性。与哈氏弧菌标准菌株的相关形态和生理生化特征相比,菌株 XC08063与标准菌株完全一致,而菌株XC08061、XC08062仅分别在L-阿拉伯糖、蔗糖和 40℃培养结果存在差异,其余指标完全相同。

2.3.2 16S rDNA序列测定与分析

分别以菌株 XC08061、XC08062、XC08063的总DNA为模板,经细菌16S rDNA通用引物扩增均获得约 1500 bp的基因片段,对其测序并提交Genbank核酸序列数据库,登录号分别为GQ180184、GQ180185、GQ180186。将这 3株菌株的基因序列与 Genbank中同源性最高的及亲缘关系较远的共29株其他菌株的基因序列进行同源性比对和多序列匹配排列,构建系统进化树(图3),结果表明,该 3株菌与 5株哈氏弧菌聚为一支,置信度达100%,同亲缘关系较远的鳗弧菌(V.anguillarum)、创伤弧菌(V.vulnificus)、河流弧菌(V.fluvialis)分支明显。结合生化鉴定和表型特征,可以判定菌株XC08061、XC08062、XC08063均为哈氏弧菌。

2.4 病原菌对褐点石斑鱼的LD50值测定

根据表1的结果,取感染实验中死亡率最高的株菌XC08061,测定其对体质量为30～35 g的健康褐点石斑鱼的LD50值。结果表明(表3),接种浓度为4.8 ×105CFU/尾时,实验鱼死亡率达100%;接种浓度为4.8 × 102CFU/尾时,实验鱼死亡率为 0。经计算,该菌株对体质量为 30～35 g的褐点石斑鱼 LD50值为5.8 × 102CFU/g 鱼体质量。

2.5 药敏试验

选取25种抗菌药物分别对菌株XC08061进行药敏检测,结果表明(表4),该菌株只对新生霉素、头孢噻肟、先锋必/舒巴坦、诺氟沙星、依诺沙星和庆大霉素6种抗菌药物敏感;对卡那霉素、头孢肤肟、呋喃妥因等6种抗菌药物中度敏感,对链霉素、先锋霉素V、乙酰螺旋霉素等13种抗菌药物均不敏感,总体具有较强的耐药性。

3 讨论

褐点石斑鱼脱鳞病是近年来海南陵水等地褐点石斑鱼养殖中常见的爆发性疾病,该病爆发速度快、死亡率高,对海南褐点石斑鱼养殖造成了巨大的危害。作者从病鱼的肝脏、脾脏和肾脏组织中分离了XC08061、XC08062和 XC08063共3株细菌,回归感染试验结果表明它们均属于该病的病原菌。该 3株菌虽然在生理生化检测结果与哈氏弧菌标准菌株最为接近,但前两个菌株的个别检测指标与哈氏弧菌标准菌株还存在差异。Mercedes等[9]及Noguerola等[14]认为,细菌生化鉴定的一些指标存在可变性,以其判定细菌种类具有一定的不确定性,为此,作者进一步利用 16S rDNA序列比较对生理生化鉴定结果进行验证。一般认为,不同菌株16S rDNA序列的同源性高低与其亲缘关系呈正相关,同源性大于97.5%的菌株可视为同种[15-16],不过,也有 16S rDNA序列同源性大于97.5%的菌株却属于不同种的情况,如哈氏弧菌与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)(Genbank登录号：EU660363)以及需钠弧菌(V.natriegens)(Genbank 登录号：EU660320)的 16S rDNA序列的同源性均在 98%以上,但却属于不同种。因

此,为提高细菌种类鉴定的准确率,常常将生理生化指标测定与 16S rDNA序列的同源性分析结合起来。作者综合该2种方法的检测结果,确定石斑鱼脱鳞病的3株病原菌均为哈氏弧菌。

表2 菌株XC08061、XC08062、XC08063和哈氏弧菌标准菌株的形态及生理生化特征Tab.2 Morphological,physiological and biochemical characteristics of strains XC08061、XC08062、XC08063 and standard strain of V.harveyi

图3 以16S rDNA序列构建的弧菌系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree of Vibrio based on 16S rDNA genes

表3 不同浓度XC08061人工感染褐点石斑鱼的累积死亡率Tab.3 The accumulated mortality rate of E.fuscoguttatus infected by different concentration of strain XC08061

表4 病原菌XC08061对25种抗菌药物的敏感性Tab.4 The sensitivity of strain XC08061 to 25 chemotherapeutic agents

哈氏弧菌是一种常见的海洋生物致病菌,可导致多种海水养殖动物疾病,已报道的感染对象十分广泛,包括大黄鱼(Pseudosciaena crocea)等鱼类[17]、斑节对虾(Penaeus monodon)等虾类[18]、文蛤(Meretrix meretrix)等贝类[19]以及刺参(Stichopus japonicus)等棘皮动物[20]。该病原引起的疾病不仅死亡率高,而且发病迅速,感染后可在短时间内导致感染动物死亡[21];该病原引起疾病的症状也多种多样,除常见的体表溃烂和充血等症状外,还可引起遮目鱼(Chanos chanos)和斑节对虾的烂眼[18,22],引起军曹(Rachycentron canadum)的肠胃炎等[23]。作者对海南陵水褐点石斑鱼脱鳞病的病原检测结果表明其病原也是哈氏弧菌,该病发生后除有常见的体表溃疡症状外,最显著的症状为体侧的鳞片成片脱落,并伴有烂鳍、肝脾肿大、腹腔积水乃至因胆囊破裂而致胆汁浸染体腔等症状,与已有报道存在一定的差异。褐点石斑鱼脱鳞病发生后死亡速度快,人工感染实验表明,感染死亡的个体主要集中在感染后2 d以内,感染个体若3 d内不死亡,则在15 d内也全部成活,与 Estes等[21]报道的太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)幼虫哈氏弧菌病相似。

LD50值是评价外源性物质对受其影响的动物的毒性大小的重要参数,也是评价病原菌对水产养殖生物危害性的主要指标之一[24]。陈献稿等[7]用哈氏弧菌腹腔注射感染斜带石斑鱼(E.coioides)所得的LD50值为2.7 × 106CFU/g鱼体质量;Liu等[23]用哈氏弧菌腹腔注射平均体质量为 10 g的军曹幼鱼 LD50值为7.48 × 104CFU/g鱼体质量。作者所分离的哈氏弧菌菌株XC08061腹腔注射感染平均体质量为32.5 g的褐点石斑鱼所得LD50值仅为5.8 × 102CFU/g鱼体质量,低于陈献稿等对斜带石斑鱼感染结果和Liu等对军曹感染结果,说明该菌株对褐点石斑鱼具有较强毒性。

对于养殖鱼类细菌性疾病的应急治疗,使用抗生素类药物仍然是一种快速高效的手段[24]。本研究检测了25种抗菌药物病原菌XC08061的敏感性,结果只有新生霉素、头孢噻肟、先锋必/舒巴坦、诺氟沙星、依诺沙星和庆大霉素6种抗菌药物对其敏感,说明该菌株存在较强耐药性。在防治该病时可根据具体情况考虑选择此6种药物。不过,由于抗生素类药物存在药物残留、耐药性和污染环境等显著缺陷,在水产养殖的病害防治中即使是国家尚未列入禁用药物清单的各类抗生素药物,在使用后也必须严格执行国家有关休药期的有关规定,以保证食用水产品的安全。作者对病原菌XC08061的药敏检测结果与其他学者检测的哈氏弧菌药敏结果存在一定差异[20,25],说明哈氏弧菌的药敏性可能因区域、菌株类型等的不同而存在差异。因此,在相关疾病防治时需要根据病原菌的具体情况选择合适的种类,在使用前最好对病原菌株进行药敏检测。

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