覃 亮， 路 宽， 董 基， 杨小霞

(1.肇庆学院化学化工学院，广东肇庆526061;2.肇庆市水产技术推广中心，广东肇庆526060)

红树植物桐花树Aegiceras corniculatum，紫金牛科，生长在海陆交界的潮间带地区，其多糖的组成与生物活性可能与陆生植物和海洋植物有着较大的差异［1］。多糖类化合物在自然界分布极广，广泛存在于动植物中，经研究部分多糖具有抗肿瘤和增强免疫的药理作用［2］。本实验通过提取和分离桐花树多糖组分，并对其抑菌能力进行研究，为促进桐花树的研究和开发利用提供科学依据。

1 仪器与材料

桐花树，采自湛江东海岛。大肠杆菌Escherichia coli、枯草芽抱杆菌 Bacillus subtilis、黑曲霉菌 Aspergillus mold、绿霉菌Trichoderma riride，肇庆学院化学化工学院食品工程实验室提供。

纤维素DE-52，北京鼎国生物技术有限责任公司;Sephadex G-200，Pharmacia公司，其它试剂均为国产分析纯，实验用水均为蒸馏水。

UV/VIS 916型紫外分光光度计，澳大利亚GBC公司;真空干燥箱，上海博讯实业有限公司;LRH-150细菌培养箱，海浦东荣丰科学仪器有限公司;MJX-250B-Z型霉菌培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SW-CJ-IF型净化工作台，苏州安泰空气技术有限公司。

2 方法

2.1 桐花树多糖的提取［3］桐花树粉碎至能通过40目筛，脱脂，挥干溶剂后用热水浸提。浸提液浓缩至原来体积的1/3，加3倍其体积的95%乙醇，5℃醇析过夜，离心15 min，去上清液;所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚各洗涤3次，离心5 min，收集沉淀，真空干燥，即得桐花树粗多糖。

2.2 桐花树多糖的纯化 利用DEAE-52纤维素柱层析依次用蒸馏水、0.05 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaCl，0.4 mol/L NaCl和0.1 mol/L NaOH溶液洗脱，分部收集器进行收集，每管收集5 mL，用苯酚-硫酸法跟踪检测，合并单一峰，浓缩、透析、真空冷冻干燥。

利用Sephadex G-200柱层析对DEAE-52纤维素柱层析得到的较大组分进行进一步纯化。洗脱液为0.2 mol/L NaCl，分部收集器进行收集，每管收集3 mL，用苯酚-硫酸法跟踪检测，合并收集主峰部位，浓缩、干燥得到两个桐花树多糖纯品桐花树多糖-Ⅰ、桐花树多糖-Ⅱ。

2.3 桐花树多糖的抑菌实验 选取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌、绿霉菌4种食品常见微生物对桐花树多糖进行抑菌性实验，确定出所抑菌的种类和最低抑菌浓度(MIC)。

2.3.1 培养基制备 细菌用牛肉膏蛋白胨培养基，霉菌用马铃薯蔗糖培养基［4］。

2.3.2 供试菌种的活化及菌悬液的制备 在对应的培养基上活化实验所需的供试菌种，细菌置37℃恒温培养箱中培养24 h，真菌置28℃恒温培养箱中培养48 h。分别挑取一环已活化好的菌种放入无菌生理盐水中，10倍梯度稀释，制成浓度为107～108cfu/mL的菌悬液备用［5-6］。

2.3.3 桐花树多糖溶液的配制 准确称取100 mg桐花树多糖，用无菌水溶解，配成8 mg/mL的多糖溶液，用2倍稀释法配制成4、2、1、0.5 mg/mL不同质量浓度的多糖溶液，备用［7］。

2.3.4 桐花树多糖的抑菌作用测定［8］采用滤纸片法［9-10］测定桐花树多糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌、绿霉菌4种受试菌的抑制作用。将直径为9 mm的圆形滤纸片，灭菌后取数片分别放入桐花树多糖溶液 (8 mg/mL)、无菌生理盐水、6%苯甲酸钠溶液中浸泡30 min，取出在无菌条件下风干。分别取浸有供试液、6%苯甲酸钠溶液及无菌生理盐水的滤纸片各3片间隔一定距离贴在涂布好的含菌平板上，置于适宜温度下进行培养，测量其抑菌圈直径，比较抑菌效果［11］。

2.3.5 最小抑菌浓度 (MIC)的测定［12-13］选取桐花树多糖抑菌效果较好的菌种为供试菌种，以2.3.3项配好的不同质量浓度的桐花树多糖溶液为供试液，采用滤纸片法测定不同质量浓度供试液的抑菌圈，以出现抑菌圈的最低质量浓度为最小抑菌浓度 (MIC)。

3 结果与讨论

3.1 桐花树多糖的提取 桐花树多糖提取率为25.32%。

3.2 桐花树多糖DEAE-52纤维素柱层析结果 见图1。

图1 DEAE-52纤维素柱层析分离结果

由图1可知，桐花树多糖经DEAE-52纤维素柱洗脱后得到两个洗脱峰桐花树多糖-Ⅰ (蒸馏水)、桐花树多糖-Ⅱ(0.4 mol/L NaCl)，各组分经减压浓缩，透析，冷冻干燥后，得率分别为5.45%、43.11%。

3.3 桐花树多糖经Sephadex G-200柱层析结果 利用Sephadex G-200柱层析对DEAF-52柱层析得到的两个较大组分桐花树多糖-Ⅰ、桐花树多糖-Ⅱ进一步纯化的结果见图2和图3。由图可知，DEAE-52纤维素柱的两个洗脱峰经Sephadex G-200柱层析后均得到单一峰，表明纯化后的桐花树多糖为单一组分多糖。

图2 桐花树多糖-Ⅰ的Sephadex G-200柱层析洗脱曲线

图3 桐花树多糖-Ⅱ的Sephadex G-200柱层析洗脱曲线

3.4 桐花树多糖抑菌实验结果

3.4.1 桐花树多糖对4种微生物的抑制作用 桐花树多糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌、绿霉菌4种食品常见微生物的抑制作用效果见表1。桐花树多糖在实验质量浓度 (8 mg/mL)时，对绿霉菌均无抑制作用，而对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌有选择性抑制作用，抑菌圈直径越大，说明抑菌效果越好。

表1 桐花树多糖对4种不同微生物的抑制作用 (n=3)

3.4.2 桐花树多糖的最小抑菌浓度 (MIC) 以大肠杆菌、枯草芽抱杆菌，黑曲霉菌为供试菌，利用滤纸片法测定桐花树多糖、桐花树多糖-Ⅰ、桐花树多糖-Ⅱ的最小抑菌浓度。由表2，表3，表4可以看出，不同多糖出现抑菌圈的最低质量浓度各不相同。桐花树多糖、桐花树多糖-Ⅰ、桐花树多糖-Ⅱ对大肠杆菌的MIC值为2 mg/mL、1 mg/mL、4 mg/mL，桐花树多糖、桐花树多糖-Ⅰ对枯草芽孢杆菌的MIC值为2 mg/mL与4 mg/mL，桐花树多糖、桐花树多糖-Ⅱ对大肠杆菌、黑曲霉菌有抑菌作用的MIC值为4 mg/mL与8 mg/mL。

4 结论

本实验对桐花树多糖的提取和抑菌活性作了初步的研究，通过用Sephadex G-200柱和DEAE-52纤维素柱分离出两种纯度较高的多糖桐花树多糖-Ⅰ、桐花树多糖-Ⅱ。抑菌实验结果表明，桐花树多糖具有一定的抑菌活性，对所抑菌的种类具有选择性，桐花树多糖对绿霉菌无抑制作用，桐花树多糖-Ⅰ对黑曲霉菌、绿霉菌无抑制作用，桐花树多糖-Ⅱ对枯草霉菌、绿霉菌无抑制作用。桐花树多糖和分离出来的多糖组分桐花树多糖-Ⅰ、桐花树多糖-Ⅱ表现出来的抑菌能力也不相同，并不是单纯的抑菌能力叠加关系，这可能与粗多糖中存在其他抑菌成分有关。本研究结果具有一定的理论和应用价值，为桐花树在食品和医药防腐领域的应用提供了研究基础。

表2 桐花树多糖对大肠杆菌的抑菌效果 (n=3)

表3 桐花树多糖对枯草芽抱杆菌的抑菌效果 (n=3)

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