陈永青 郑 续 邵蒙蒙 王小同

目前，慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)已经不再单纯的被认为是一个肺脏疾病，还累及多个肺外器官，其肺外表现有骨骼肌功能障碍、体重减轻、骨质疏松症、心血管疾病等［1］。尤其是骨骼肌萎缩及体重减轻，在COPD患者的自然病程中普遍存在，近年来有关研究认为骨骼肌萎缩与COPD患者的病死率密切相关，Agusti等［2，3］在严重体重下降的COPD患者中发现骨骼肌细胞凋亡增加，导致骨骼肌纤维数量减少，从而引起骨骼肌萎缩，提示凋亡引起的细胞死亡也许是COPD骨骼肌萎缩的重要机制之一。本课题组前期研究已发现，慢性低氧高二氧化碳血症可导致小鼠骨骼肌凋亡指数明显升高，并出现肌纤维局部萎缩和线粒体部分损害，伴有炎症细胞浸润增多，提示凋亡可能参与了COPD引起的小鼠骨骼肌萎缩，炎症反应激活的死亡受体途径及线粒体途径可能参与了COPD引起的骨骼肌细胞凋亡［4］。本实验模拟COPD的发病机制，建立COPD模型，通过观察干预后的caspase－3的含量变化，进一步探讨凋亡是否参与了COPD导致的骨骼肌萎缩，同时观察实验组与正常对照组Cyt－C及细胞凋亡因子Bax、Bcl－2基因的表达情况，探讨线粒体途径在慢性低O2高CO2小鼠骨骼肌细胞凋亡中的作用及其可能的调节机制。

材料与方法

1.仪器与设备:动物实验复合模拟舱(潍坊华信氧业有限公司)、酶标仪(芬兰Thermo公司)、洗板机(芬兰Thermo公司)、LithtCycler480实时定量PCR仪(罗氏公司)。

2.实验动物及分组:成年storage protect feature(SPF)级雄性C57BL/6小鼠16只(由温州医学院实验动物中心提供)，体重20～30g，按随机数字表法分为实验组8只和正常对照组8只。

3.模型建立:实验组置于低O2高CO2舱中(吸入气O2浓度为9.0%～11.0%，CO2浓度为5.0%～6.0%)，每天8h，每周6天。其余时间与对照组在同一室内(室温15～20℃，相对湿度50%～70%)，对照组除吸入空气外(正常空气中O2浓度为21%，CO2浓度为0.03%)，其他条件与实验组相同［5］。

4.骨骼肌组织取材:干预结束后，用1%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，仰卧固定，迅速分离，取左右两侧股外侧肌，经液氮冷冻后放入－70℃冰箱保存，用于ELISA测定和实时定量荧光PCR测定。

5.ELISA法测定caspase－3含量:称量骨骼肌重量，加入90%体积冰PBS液(pH=7.4)，研磨钵充分研磨，1500r/min离心10min(4℃中进行)，取上清液，制成10%的组织溶液，4℃保存待测。用ELISA法检测样本中caspase－3的含量。严格按照说明书操作步骤进行，于酶标仪上450nm波长检测各孔的光密度(optical density，OD)值。用Ascent software for Multiskan分析软件，以OD值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，根据样本的OD值在标准曲线上读出样本中所测物质的量。

6.实时荧光定量PCR检测Cyt－CmRNA、BaxmRNA、Bcl－2 mRNA的表达:用Trizol(Invitrogen公司)抽提总mRNA，提取1μl RNA样品，采用紫外分光光度法测定RNA纯度，以OD260/OD280的比值表示，要求比值在1.8～2.0之间。根据反转录试剂盒(Fermentas公司)说明书操作，进行反转录。PCR引物由大连宝生物工程有限公司设计并合成。Cyt－C引物序列为上游:5'－agcctgggctacacagagaa－3'，下游:5'－actcacacaacctgctgcac－3';Bax引物序列为上游:5'－tgcagaggatgattgctgac－3'，下游:5'－gatcagctcgggcactttag－3';Bcl－2引物序列为上游:5'－aggagcaggtgcctacaaga－3'，下游:5'－gcattttcccaccactgtct－3'，采用GAPDH作为内参照。用LithtCycler 480实时定量PCR仪(罗氏公司)检测，实验重复3次。通过比较△Ct的方法进行目的基因表达的定量分析，Cyt－C、Bax、Bcl－2的相对表达量用2－△△Ct表示。Ct为每个反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，△Ct为Cyt－C mRNA、BaxmRNA、Bcl－2 tmRNA值与内参照Ct值之差。△△Ct值为实验组Cyt－CmRNA、Bax mRNA、Bcl－2 tmRNA△Ct值与正常对照组△Ct值之差。

结果

1.骨骼肌细胞质内caspase－3的水平:与正常对照组(n=8)25.76±5.20ng/m l相比，实验组(n=8)骨骼肌细胞内caspase－3水平(39.69±14.66ng/ml)升高(P＜0.05)。

2.荧光实时定量PCR结果:定量PCR结果采用2－△△Ct相对表达量分析法，以正常对照组基因表达量作为基数，在此基础上比较实验组的Cyt－CmRNA、BaxmRNA、Bcl－2 mRNA表达量。实验组的Cyt－C mRNA、BaxmRNA、Bcl－2 mRNA的2－△△Ct值分别为5.80±0.70、20.56±3.03、0.93±0.23。说明相对于正常对照组，实验组的Cyt CmRNA、Bax mRNA呈高表达，而Bcl－2 mRNA呈低表达(表1)。

表1 实验组小鼠骨骼肌Cyt C mRNA、Bax m RNA、Bcl－2 mRNA的表达±s)

表1 实验组小鼠骨骼肌Cyt C mRNA、Bax m RNA、Bcl－2 mRNA的表达±s)

指标 △△Ct值 2－△△Ct 值Cyt－CmRNA －2.57±0.14 5.80±0.70 BaxmRNA －4.34±0.22 20.56±3.03 Bcl－2 mRNA 4.34±0.58 0.05±0.01

讨论

COPD是一种全身性疾病，除了有典型的肺部病理表现外，肺外表现如骨骼肌功能障碍也成为近几年的研究热点。骨骼肌萎缩作为COPD的肺外效应愈来愈受到人们的关注，引起骨骼肌萎缩的原因有很多，如能量摄人不足、能量消耗过多、蛋白质分解代谢异常及炎症刺激、组织缺氧、皮质激素的使用等，但其具体的分子生物学机制尚未明确。近年来，有研究认为细胞凋亡是COPD骨骼肌萎缩的原因之一，也有研究认为在COPD的稳定期，体重相对恒定的患者并未发现骨骼肌细胞凋亡［5，6］。因此，细胞凋亡是否参与了COPD骨骼肌萎缩，及其可能的作用机制，有待进一步证实。

细胞凋亡是细胞循自身程序结束其生命的主动死亡的过程，具有特征的形态和生化改变，是由基因控制的个别细胞发生的自主有序的死亡。本研究结果显示，与正常对照组比较，实验组小鼠骨骼肌细胞胞质内caspase－3含量增加，caspase－3处于凋亡有序级联反应的下游，是细胞凋亡的内源性途径(线粒体途径)和外源性途径(死亡受体途径)的重要汇聚点，主要与细胞凋亡的最终执行有关，是效应caspase。本实验进一步证实凋亡参与了COPD导致的骨骼肌萎缩［7］。

Cyt－C是第1个被发现的促凋亡蛋白，在线粒体呼吸链中传递电子，起到载体的作用，其从线粒体释放到细胞质这一过程是引起细胞凋亡的关键［8］。本实验慢性低O2高CO2导致小鼠骨骼肌线粒体损伤，Cyt－C被释放到胞质中，与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf－1)、dATP、procaspase－9组成凋亡体(apoptosome)，凋亡体使procaspase－9激活，进而激活其下游的procaspase－3，活化的caspase－3启动细胞凋亡［9］。本研究通过RT－PCR检测到实验组骨骼肌细胞胞质内Cyt－C mRNA表达较正常对照组增加(P＜0.05)，提示线粒体途径是COPD骨骼肌细胞凋亡的可能机制之一。

Bcl－2家族是目前较为公认的与凋亡密切相关的基因，包括抗凋亡的Bcl－2和促凋亡的Bax蛋白等，其主要调控线粒体途径。有研究表明，Bcl－2家族成员定位于线粒体膜上，其主要通过调节线粒体外膜的通透性和完整性来发挥作用［10］。本实验观察到:与正常对照组相比，实验组小鼠骨骼肌Bax mRNA表达增高，而Bcl－2 mRNA表达降低，Bax受到慢性低O2高CO2刺激后能够发生空间构象改变，通过被暴露的C末端疏水结构域插入到线粒体外膜上，改变线粒体膜的通透性致使Cyt－C释放，进而激活下游的caspases－3，最终导致细胞凋亡［11］。Bcl－2是一种最早被发现的抑制细胞凋亡的蛋白，主要位于线粒体，可以调节膜的通透性，其抑制细胞凋亡的作用与Bax的促凋亡作用相对［12，13］。Bcl－2与Bax的比值对细胞凋亡起决定作用，Bcl－2/Bax下降是促进细胞线粒体途径凋亡的重要因素。本研究显示，实验组小鼠骨骼肌细胞内Bcl－2/Bax下降，加速了线粒体途径的细胞凋亡，促进骨骼肌细胞的死亡。

总之，本研究进一步证实凋亡参与了COPD引起的骨骼肌萎缩，线粒体途径可能是COPD骨骼肌细胞凋亡的机制之一，至于COPD是否同时通过其他机制促进骨骼肌细胞的凋亡，尚有待进一步研究探讨。另外，Bcl－2/Bax下降可能是促进骨骼肌细胞线粒体途径凋亡的重要因素。

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