章顺荣 高 越 封 菲 洪鸣鸣

糖尿病常引起大小血管病变，大血管病变中最常见的是动脉粥样硬化，糖尿病是冠心病的等危症，然而糖尿病易患动脉粥样硬化的机制仍未完全明了。糖尿病血管并发症的发病机制中晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)起着重要作用，AGEs可以通过多种机制促进动脉粥样硬化的发生发展［1］。AGEs能引起内皮细胞结构和功能异常，而后者在动脉粥样硬化的发病机制中起着关键作用。组成缝隙连接的蛋白亚单位称为connexins，现已发现20种以上的connexins亚型，内皮细胞表面有connexin37、40和43的表达［2］。connexins在维持内皮整体功能协调中起着重要作用，研究表明connexin43的改变与内皮功能异常及动脉粥样硬化的发生发展相关［3］。AGEs是否可以通过影响内皮细胞connexin43表达而促进动脉粥样硬化的发生发展尚不明确。本研究对AGEs是否可影响体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelium cells，HUVECs)connexin43的表达做一探索。

材料与方法

1.材料:牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，D－葡萄糖，1640细胞培养液，胰酶，磷酸盐缓冲液(PBS)和胎牛血清购自上海泽衡生物科技公司，内皮细胞株购自南京凯基生物科技公司，Trizol和 RT－PCR试剂盒购自Invitrogen公司，connexin43和GAPDH引物对由上海泽衡生物科技公司合成，兔抗人connexin43多克隆抗体购于Abcam公司(Catalog Number ab62689)，荧光标记的羊抗兔IgG抗体，山羊血清，C液购自北京中杉金桥生物科技有限公司，Triton X－100购自上海生工生物工程有限公司，DAB显色液购自福州迈新生物技术开发有限公司。

2.AGEs的制备:0.5mol/L的D－葡萄糖和50mg/m l牛血清白蛋白溶解在0.2mol/L的磷酸盐缓冲液中，用0.2μm的滤器过滤除菌后置于37℃恒温箱内避光孵育。90天后取出，AGE－BSA呈深黄色，装入低分子量透析袋，以PBS液充分透析72h，中途更换透析液1～2次以除去未结合的低分子物质。透析后用0.2μm的滤器过滤除菌后－80℃保存。用荧光分光光度计检测AGE－BSA最大发射波长为460nm，最大激发波长为360nm，检测AGE－BSA的蛋白浓度为50mg/m l。

3.内皮细胞培养及AGEs的干预:人脐静脉内皮细胞株接种于6孔板培养基，常规传代，待内皮细胞生长至约80%满后换液，对照组继续以含10%胎牛血清的1640培养液培养，而另外3组则在10%胎牛血清的1640培养液中分别加入不同浓度的AGEs，使AGEs的终浓度分别为100mg/L，200mg/ L，400mg/L。继续培养24h后，去除培养液，PBS液冲洗后，加入Trizol 2ml，提取各组的总RNA，－20℃条件下保存。另两组内皮细胞按2×104/ml浓度接种于含有载玻片的6孔板培养基，分为对照组和200mg/L AGEs干预组，待内皮细胞生长至铺满80%玻片后换液，对照组继续以含10%胎牛血清的1640培养液培养，干预组则在培养液中加入终浓度为200mg/ L的AGEs，继续培养24h后去除培养液，PBS液冲洗后进行免疫荧光染色。

4.connexin43基因mRNA表达水平的检测:提取的各组RNA通过紫外分光光度计测定260和280nm处吸光度值，计算RNA纯度和浓度。按反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增。Premier5.0软件设计PCR引物对，connexin43基因的PCR引物序列为5'－GAGCGGATAC AGAGGAG GA－3'(上游)，5'－CTCCACCCATCTACCCCATAC－3'(下游)。内参GAPDH的引物序列为:5'－CGTGAAAGATGTCGTGGAA－3'(上游)，5'－TGGAAGATGGTGA TG GGAT－3'(下游)。connexin43基因PCR扩增条件为: 95℃ 5min 1循环，之后95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环，最后72℃ 10min 1循环，产物长度为383次/分;内参GAPDH基因PCR扩增条件为:95℃5min 1循环，之后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环，最后72℃10min 1循环，产物长度为223bp。PCR反应体系为20μl体系。PCR反应产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳判断结果，Bio RAD成像系统拍摄照片用于分析。

5.connexin43蛋白表达水平的检测:主要步骤如下:①PBS清洗标本3次各1min;②4%的多聚甲醛固定20min;③空气干燥5min;④PBS清洗标本3次各2min;⑤0.5%Triton X－100孵育1次20min;⑥PBS清洗标本3次各2min;⑦3% H2O2孵育15min，DPBS清洗标本3次各2min;⑧标本予以兔抗人connexin43多克隆抗体(效价1∶200)4℃孵育过夜;⑨PBS液冲洗4次，各5min，加入荧光标记的二抗，室温孵育30min;⑩PBS液冲洗4次后90%甘油封片。最后在荧光显微镜下观察结果，拍摄照片用于分析。

6.统计学方法:运用ImageJ 1.43图像分析软件对mRNA电泳图片和免疫细胞荧光染色图片进行灰度扫描半定量分析。运用SPSS 13.0统计软件包进行数据统计分析。mRNA电泳图片采用各组connexin43条带与其GAPDH条带的灰度比值作为统计变量，采用t检验分析;免疫细胞荧光染色图片以细胞灰度值作为统计变量，采用t检验分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结果

1.AGEs对内皮细胞connexin43基因mRNA表达的影响:不同浓度(100、200、400mg/L)的AGEs干预24h后引起内皮细胞connexin43 mRNA的表达水平上调(表1和图1)。

表1 不同浓度AGEs对HUVECs connexin43 m RNA表达的影响(n=6±s)

表1 不同浓度AGEs对HUVECs connexin43 m RNA表达的影响(n=6±s)

*与对照组相比，P＜0.01

0.38±0.024 100mg/L AGEs干预组 0.94±0.037* 200mg/L AGEs干预组 1.01±0.034* 400mg/L AGEs干预组 0.92±0.065组别 灰度比值对照组*

图1 不同浓度(100、200、400mg/L)的AGEs刺激后内皮细胞connexin43 m RNA表达水平

2.AGEs对内皮细胞connexin43基因蛋白表达的影响:见图2。对照组及200mg/L的AGEs干预组24h后 connexin43灰度值分别为 64.28±4.34、97.41±6.80。免疫荧光方法检测发现内皮细胞connexin43的蛋白表达水平上调(P＜0.01)。

图2 免疫荧光染色结果

讨论

糖尿病常引起全身大血管和小血管病变，研究表明合并糖尿病的冠心病患者冠状动脉粥样硬化病变更严重、更弥漫，AGEs在糖尿病血管病变的发生发展中起着关键的作用［4］。AGEs的形成先由还原葡萄糖的醛基或酮基与生物分子如蛋白质或脂质的游离氨基反应形成早期可逆产物碱，再经分子内重排形成更稳定的产物进一步脱水和凝聚形成不可逆的终末产物，呈棕黄色，可发荧光，糖尿病及慢性肾功能不全患者，体内AGEs的积聚明显增加［5］。AGEs能通过多种途径促进动脉粥样硬化的发生发展。AGEs刺激血管内皮细胞能增加诱导型一氧化氮合酶mRNA表达，诱导内皮细胞表达内皮素－1、血管细胞黏附分子－1、细胞间黏附分子－1、E－选择素、组织因子、血栓素、白细胞介素IL－1、IL－6、肿瘤坏死因子，以及AGEs受体(RAGE)等，促使内皮细胞凋亡，引起单核－吞噬细胞迁移，吞噬脂质，启动动脉粥样硬化的病理过程，促进早期动脉粥样硬化斑块的形成［6］。研究表明，抑制糖尿病患者体内AGEs的形成能有效延缓动脉粥样硬化的进展［7］。

近年来connexin43在动脉粥样硬化发病机制中的作用日益引起人们的重视［8］。人类冠状动脉粥样硬化的早期，其增厚的内膜中缝隙连接蛋白connexin43表达明显增强［9］。Kwak等［10］研究表明通过connexin43基因半敲除的LDL受体基因缺陷的小鼠(LDLR－/－Cx43+/－)与LDL受体基因缺陷的带有正常connexin43基因的小鼠(LDLR－/－Cx43+/ +)相比，其connexin43蛋白表达减少，喂养高胆固醇饲料14周后其胸腹主动脉和主动根部动脉粥样病变比LDLR－/－Cx43+/+减少50%(P＜0.01)，且LDLR－/－Cx43+/－小鼠粥样硬化斑块中含更少的炎症细胞，有更厚的纤维帽，含更多的胶原和平滑肌细胞。他汀类调脂药能减少血管内皮细胞connexin43的表达，而他汀类药物的抗动脉粥样硬化作用可能也与此有关［11］。Dai等［12］模拟斑块易感和抵抗区域的动脉波型，应用于培养的内皮细胞，对其表型进行了观察，结果发现斑块易感波形引起connexin43表达上调。Chadjichristos等研究发现connexin43基因半敲除的LDL受体基因缺陷的小鼠(LDLR－/－Cx43+/－)球囊损伤颈动脉内膜后其新生内膜的厚度比LDLR－/－Cx43+/+的小鼠减小，巨噬细胞浸润也更少。总之，目前的研究提示内皮connexin43可能具有促动脉粥样硬化作用，减少connexin43的表达能相应的减轻动脉粥样硬化病变的程度。而作为糖尿病血管病变关键因素的AGEs能否影响内皮细胞connexin43的表达尚不清楚，这是一个值得研究的靶点。

本研究用AGEs干预体外培养的人脐静脉内皮细胞，以观察AGEs能否影响人脐静脉内皮细胞connexin43的表达。结果发现不同浓度(100、200、400mg/L)的AGEs均能引起人脐静脉内皮细胞connxin43基因mRNA的表达增加;200mg/L的AGEs干预人脐静脉内皮细胞24h后可引起connexin43蛋白的表达水平增加。这些结果提示AGEs干预内皮细胞后在转录水平引起缝隙连接蛋白connexin43基因的表达上调。由于内皮connexin43可能有促动脉粥样硬化作用，AGEs可通过上调血管内皮细胞connexin43的表达而促进动脉粥样硬化的发生发展。

AGEs引起内皮细胞connexin43基因表达上调的机制尚有待于进一步研究明确。目前研究表明人类connexin43基因的转录调控，涉及转录因子Sp1、Sp3、AP1、Nkx2.5、Tbx2等，此外，几条信号通路也参与了connexin43的转录调控。AGEs与其受体RAGE结合可激活内皮细胞多种信号转导通路，引起多种核转录因子的激活和转位，启动多种靶基因的转录，其中也可能包括connexin43基因，进而引起内皮细胞connexin43的表达上调，当然尚有待于进一步研究证实。

总之，本实验研究初步提示，AGEs短期干预能引起体外培养的人脐静脉内皮细胞缝隙连接蛋白connexin43基因mRNA和蛋白的表达水平增加，提示内皮connexin43在AGEs促动脉粥样硬化的发病机制中起着重要的作用。本研究对糖尿病患者动脉粥样硬化发病机制的进一步探索具有一定的意义，对动脉粥样硬化的防治也有一定启示作用。

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4 Yamagishi S.Role of advanced glycation end products(AGEs)and receptor for AGEs(RAGE)in vascular damage in diabetes［J］.Exp Gerontol，2011，46(4):217－224

5 Zong H，Ward M，Stitt AW.AGEs，RAGE，and diabetic retinopathy［J］.Curr Diab Rep，2011，11(4):244－252

6 Jandeleit－Dahm K，Watson A，Soro－Paavonen A.The AGE/ RAGE axis in diabetes－accelerated atherosclerosis［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2008，35(3):329－334

7 Josephine F，Louis TL，Vicki T，et al.Advanced glycation end product interventions reduce diabetes－accelerated atherosclerosis［J］.Diabetes，2004，53(7):1813－1823

8 Morel S，Burnier L，Kwak BR.Connexins participate in the initiation and progression of atherosclerosis［J］.Semin Immunopathol，2009，31(1):49－61

9 Chadjichristos CE，Morel S，Derouette JP，et al.Targeting connexin 43 prevents platelet－derived growth factor－BB－induced phenotypic change in porcine coronary artery smooth muscle cells［J］.Circ Res，2008，102(6):653－660

10 Kwak BR，Veillard N，Pelli G，et al.Reduced Connexin43 expression inhibits atherosclerotic lesion formation in low－density lipoprotein receptor－deficientmice［J］.Circulation，2003，107(7):1033－1039

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12 Dai G，Kaazempur－Mofrad MR，Natarajan S，et al.Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis－susceptible and－resistant regions of human vasculature［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(41):14871－14876