刘维亮 李 芳 何志旭 蒋红雨 艾 戎 (贵阳医学院附属医院儿科，贵阳550004)

Wiskott-Aldrich综合征(Wiskott-Aldrich syndrome，WAS)是一种罕见的X连锁隐性遗传的原发性免疫缺陷病，又称湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征，临床特征为血小板减少伴小血小板、湿疹、反复感染、易患淋巴系统恶性肿瘤和自身免疫性疾病。1994年通过定位克隆技术分离出致病基因WAS蛋白(Wiskott-Aldrich protein，WASP)基因。WASP基因位于X染色体短臂Xp11.22-11.23，约长9 kb，含12个外显子，编码502个氨基酸［1］。WASP基因突变可影响WASP表达，导致造血细胞对外界刺激反应时的信号传导和细胞骨架组合障碍，影响血小板数量、大小及聚集，造成淋巴细胞迁移，信号传导及免疫突触形成异常等［2］。WASP基因突变可产生多种临床表型。WASP基因突变、WASP表达与临床表型密切相关，国内对该病研究相对较少，我们通过对一Wiskott-Aldrich综合征家系进行临床及WASP基因遗传学研究，初步探讨该病的临床特征及致病基因突变特点。

1 材料与方法

1.1对象 患儿，男，1岁5月，因“反复感染，血小板减少，皮疹11月”入院，考虑湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征(WAS)，该患儿及其父母为本研究对象。

1.2方法

1.2.1基因组DNA的提取 留取患儿外周静脉血1～3 ml，EDTA 抗凝，酚-氯仿法提取基因组DNA，于-20℃冰箱保存备用。本研究得到了贵阳医学院附属医院伦理委员会的批准，基因分析获取了患儿家长的知情同意。

1.2.2突变检测 针对WASP基因所有12个编码外显子及外显子和内含子交界处进行PCR扩增测序。PCR扩增引物设计及条件参照文献［3］，PCR反应体系为50 μl中进行，含10×PCR缓冲液，0.1 mmol/L dNTPs，20 mmol/L Mg2+和 1.25 U Taq DNA polymerase，10 pmol/μl上下游引物，模板 DNA 200 ng，测序用PCR产物应用双脱氧末端终止法进行测序(美国ABI公司3730XL测序仪)。测序结果在BioEdit软件中进行分析，并与GeneBank数据库中人类基因组序列WASP进行比对分析，以检测有无序列突变。先取患者做突变分析，若测序证实突变者，在家系内其父母中进行突变分析，以确认患儿该突变是源自遗传传递还是自发突变。

2 结果

2.1临床表现及实验室检查结果 患儿，男，1岁5月，贵州籍，母亲为孕2产2，患儿精神运动发育未见特殊。有1姐姐3岁体健。患儿于3月龄时有暗红色血丝便;6月龄时有头皮、颜面部湿疹，伴水疱及脱屑;从6月龄起反复发生肺炎，频率约每月1次，常有腹泻;患儿湿疹加重与感染明显相关;且从6月龄起发现血小板反复减少，四肢反复出现针尖至针帽大小出血点，身体多处见瘀斑，患儿1岁时曾有数次少量鼻出血，多次使用甲强龙琥珀酸钠及静脉用人免疫球蛋白冲击治疗，血小板波动于5×109～67×109L-1间。查体：T 38.8℃，P 120 次/分，R 32 次/分，BP 88/56 mmHg，Wt 8 kg ，营养中等，精神差，呼吸稍促，贫血及轻度脱水貌，皮肤弹性差，皮肤粘膜、甲床苍白，双下肢可见陈旧性瘢痕及针尖大小出血点，不高起皮面，压之不褪色，浅表淋巴结未扪及肿大，前囟稍隆起，约0.8 cm×0.8 cm，眼窝凹陷，双瞳孔等大等圆，直径约2.5 mm，光敏。口周苍白，咽红，扁桃体无肿大，颈软，双肺呼吸音粗，偶闻及痰鸣音。心率120次/分，律齐，有力，各瓣膜听诊区未闻及杂音，腹平软，肝肋下1 cm，剑突下1 cm，质软、无压痛，脾未扪及肿大，肠鸣音存，移动性浊音(-)。四肢肌力肌张力可，肢端温暖，生理反射存在，病理反射无特殊。辅查：血常规示：WBC 22.88×109L-1，NEUT#19.35 × 109L-1，L 2.83 × 109L-1，RBC 3.29 ×1012L-1，HGB 63.00 g/L，PLT 60 ×109L-1，MPV 5.5fl，网织红细胞计数 48.8 ×109L-1，网织红细胞百分比1.48%。血生化：谷丙转氨酶19.3 U/L(10～40)，谷草转氨酶30.64 U/L(10～42)，超敏C反应蛋白90 mg/L(0～8)，CO2结合力22 mmol/L(21 ～31)，K+3.45 mmol/L(3.5 ～5.5)，Na+135.7 mmol/L(135～145)。尿常规阴性，大便常规：稀便，潜血弱阳性。TORCH：巨细胞病毒抗体IgM，IgG阳性。Coomb＇s试验阳性。胸片示：左上肺感染。骨髓涂片：成熟红细胞部分中度小细胞轻度低色素，骨髓细胞内外均缺铁，巨核细胞数目过少。淋巴细胞及亚群：CD3(T)60.2%(64.62% ～77.08%)，CD4(Th)19.0%(32.69% ～44.23%)，CD8(Ts)31.4%(24.81% ～35.99%)，CD4/80.61(1.04～1.72)，CD19(B)14.3%(6.38% ～12.46%)，CD16+56(NK)25.2%(14.47% ～30.27%)，T+B+NK 99.7%(85.47% ～119.81%)。体液免疫(1岁1月)：IgG 11 933 mg/L(3 490～11 390)(5天前曾输注人免疫球蛋白冲击治疗)，IgA 1 194 mg/L(130～820)，IgM 1 698 mg/L(480～2 290)，抗体测定：类风湿因子测定283 U/ml(0～30)，抗核抗体(ANA)1∶100阳性核均质型++;患儿1岁5月时复查：IgG 21 500 mg/L(4+月前曾输注人免疫球蛋白冲击治疗)，IgA 1 620 mg/L，IgM 1 340 mg/L，抗体测定：类风湿因子测定480 U/ml，ANA 1∶100阳性核均质型、胞浆颗粒型。诊断：1.Wiskott-Aldrich综合征;2.脓毒血症?;3.支气管肺炎;4.小儿腹泻伴轻度脱水;5.自身免疫性溶血性贫血(中度);6.抽搐原因：颅内感染?入院后予抗感染，输注洗涤红细胞纠正贫血，对症支持治疗等，住院第2天患儿仍持续高热，并出现反复抽搐及进行性的意识障碍，查头颅CT无明显异常。家属要求自动出院。

图1 WAS患儿 WASP 基因 c．665C ＞T(p．R211X)突变Fig．1 Mutation analysis of WASP gene by direct sequencing in the patient，c．665C ＞ T(p．R211X)，the mutation is shown by an arrow

2.2WASP基因测序结果 患儿为WASP基因第7外显子中第665位核苷酸C突变为T(c.665C＞T)，导致211位密码子发生无义突变，该位置提前出现终止密码(p.R211X);其母亲一条等位基因上也有WASP基因同一位点的相同无义突变，为此突变基因携带者;患儿父亲基因型正常(图1～3)。

图2 患儿母亲为c．665C＞T突变基因携带者Fig．2 The patient's mother was the carrier of the heterozygosis mutation(c．665C ＞T)

图3 患儿父亲的正常WASP基因序列Fig．3 The patient's father had not the heterozygosis mutation

3 讨论

WAS是一种罕见X连锁隐性遗传性原发性联合免疫缺陷病，发病率为1/100万～1/400万，多起病于6个月以内的男婴。现已发现超过300种其WASP致病基因缺陷，包括错义、无义、插入、缺失和剪接位点突变等。错义突变为本病最常见的突变类型，其他常见突变类型为剪接位点突变、缺失突变、无义突变。错义突变主要分部于WASP基因第1、2、3和4外显子上，而其他突变类型分散分布于该基因，本病已报道的5个基因突变热点为168C＞T(T45M)，290C ＞N/291G ＞N(R86S/G/C/H/L)，IVS6+5 g ＞a fs stop aa 190/normal，665C ＞ T(R211X)，IVS8+1 g＞ a/c/t，fs stop aa246。前3个突变热点主要与该病轻型表型X连锁的血小板减少症(X-linked thrombocytopenia，XLT)相关联，XLT为WAS的一种轻型表现型，XLT仅以血小板减少伴小血小板为临床特征，患儿可能出现轻度湿疹，并可能具有正常的免疫功能。而后2个突变热点主要与经典的WAS表型相关联［4］。

通过WAS表型评分标准［5］对本病的临床型表型进行评分。1分(轻型XLT)：仅有血小板减少、血小板小，无或轻度免疫缺陷;2分(重型XLT)：为轻型XLT伴轻度或暂时湿疹、轻度免疫缺陷，感染不频繁，无并发症;3分(轻型WAS)：血小板减少、血小板小、中度湿疹、免疫缺陷和感染;4分(重型WAS)：轻型WAS伴严重、难以控制的湿疹和危及生命的感染;5分：XLT或WAS伴自身免疫性疾病和(或)恶性疾病。

总结国外(http：//homepage.mac.com/kohsukeimai/WASP/WASP base.html)及 Jin 等［4］已报道的665C＞T(R211X)突变病例，其中18例WAS表型评分5分有1例(5.6%)，4分有12例，2～3分有5例，国外已报道此突变占所有WASP基因家系突变百分率为4.4%。国内报道的 R211X突变病例［6-10］，其中6例WAS表型评分5分(伴恶性肿瘤)有1例(16.7%)，4分有3例，3分有2例，此突变占所有WASP基因家系突变百分率为10.3%。国内外均报道该位点为突变热点。

通过临床特征及WASP基因检测结果，该患儿明确诊断为Wiskott-Aldrich综合征。其WAS表型评分5分，患儿 Coomb＇s试验，自身抗体中 ANA及类风湿因子均阳性，伴有自身免疫性疾病自身免疫性溶血性贫血。该患儿基因型为R211X，此基因型患儿拥有典型的WAS表型且伴有自身免疫性疾病的临床特征为国内首次报道，丰富了该病突变热点基因型的临床特征谱。

该患儿为重型WAS，本研究支持以往的观察报道，即重型患儿往往在7～12外显子发生移码或无义突变［11］。另外，R211X基因型国内外报道临床型表型差异较大，我们未行WASP表达检测，推测相同的基因型可能表达有不同的蛋白型，进而影响表型，其中可能有其他修饰基因及环境因素影响WASP基因表达而起作用。

WAS为联合免疫缺陷病，有不同程度的体液、细胞免疫异常，以T细胞免疫缺陷为主，患者免疫缺陷为渐进性，多数患者血清IgG轻度降低或正常，IgM下降，IgA和IgE升高。T细胞数量减少［9］。我们报道的患儿Th细胞数量减少，B淋巴细胞数量增加，血清IgA水平进行性升高，IgM水平进行性降低，IgG水平进行性升高可能与近期输注人免疫球蛋白冲击治疗有关。患者免疫水平的变化可能与病情进展有关。因患者的体液、细胞免疫水平变化较大，WAS诊断不应仅基于免疫分析结果。

WAS患儿临床极易误诊为特发性血小板减少性紫癜(ITP)，因WAS患儿骨髓常规检查缺乏特征性改变，两者均有血小板减少。当临床发现男性患儿持续血小板减少伴小血小板，反复湿疹、感染，免疫缺陷，特别是有小血小板时，应高度考虑WAS，可进一步行WASP基因检测及应用流式细胞术检测外周血单个核细胞WASP表达明确。骨髓或脐血干细胞移植可快速重建患儿造血及免疫系统，是目前根治WAS最有效的方法。WAS的基因治疗正在基础及临床研究中。无条件移植患者，可行脾切除，使患儿血小板数量上升，但无法纠正血小板体积小;及免疫球蛋白替换治疗。急性期控制感染、止血、输血，及对症支持治疗。

我们通过临床特征及WASP基因检测，明确诊断1例中国Wiskott-Aldrich综合征患儿。我们于国内首次报道WASP基因型(p.R211X)患儿拥有典型的WAS表型且伴有自身免疫性疾病。通过临床特征分析，有利于探讨深入的基因研究。其WASP基因突变分析对于该病患儿明确诊断，判断预后具有重要意义，尤其是对不典型和散发患儿明确诊断、检测携带者及携带者胎儿的产前检查有重要意义，特别是对相同基因型伴有不同的临床型，通过表达的不同蛋白型可进一步明确影响因素。

致谢:香港大学医学院儿科系刘宇隆、陈冠荣两位教授在课题研究中给予的技术指导。

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2 Blundell M P，Worth A，Bouma G et al．The Wiskott-Aldrich syndrome：The actin cytoskeleton and immune cell function［J］.Dis Markers，2010;29：157-175.

3 Chan K W，Lee T L，Chung B H et al．Identification of five novel WASP mutations in Chinese families with Wiskott-Aldrich syndrome［J］.Hum Mutat，2002：20：151-152.

4 Jin Y，Mazza C，Christie J R et al．Mutations of the Wiskott-Aldrich Syndrome Protein(WASP)：hotspots，effect on transcription，and translation and phenotype/genotype correlation［J］.Blood，2004;104：4010-4019.

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8 赵 琴，张志勇，赵晓东 et al．Wiskott-Aldrich综合征高危儿七例产前诊断［J］.中华儿科杂志，2012;50(1)：15-19.

9 Zhang Z Y，Xiao H Q，Jiang L P et al．Analysis of clinical and molecular characteristics of Wiskott-Aldrich syndrome in 24 patients from 23 unrelated Chinese families［J］.Pediatr Allergy Immunol，2010;21：522-532.

10 Lee P P，Chen T X，Jiang L P et al．Clinical and Molecular Characteristics of 35 Chinese Children with Wiskott-Aldrich Syndrome［J］.J Clin Immunol，2009;29：490-500.

11 Fillat C，Espanol T，Oset M et al.Identification of WASP mutations in 14 Spanish families with Wiskott-Aldrich syndrome［J］.Am J Med Genet，2001;100：116-121.