李 莎 李 岩 梁 婧 刘晓琳 (山东大学附属千佛山医院，济南250014)

目前，全球结肠癌的发病率及死亡率处于上升趋势，手术及术后辅助化疗可减缓结肠癌疾病进展。手术及多周期化疗后，患者机体免疫功能受到不同程度的损伤，自体细胞免疫治疗成为结肠癌的重要治疗手段［1］。

树突状细胞是功能强大的专职抗原提呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，可高效介导对特异性抗原的免疫应答。细胞因子诱导的杀伤细胞具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和非主要组织相容性复合体(MHC)限制性杀瘤的优点。DC-CIK细胞联合培养，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广的优点。本研究通过DC-CIK联合化疗治疗结肠癌，旨在探讨DC-CIK免疫治疗在实体瘤治疗中的有效性和安全性。

1 资料与方法

1.1一般资料 病例入选标准：①按国际抗癌联盟(UICC)1997年分期标准结肠癌TNM分期为Ⅱ、Ⅲ期术后患者;②所有病例术后病理检查证实均为腺癌;③卡氏评分KPS≥70分;④无严重心肺、肝、肾等内科疾病;⑤治疗前常规行腹部CT、全身骨ECT、心电图、血常规及肝肾功能检查正常。

收集2008年1月至2009年12月就诊于山东省千佛山医院肿瘤科的40例Ⅱ～Ⅲ期结肠癌患者符合入选标准，其中男28例，女12例，年龄35～77岁。随机选取20例作为单纯化疗组，仅行化疗，20例作为联合治疗组，给予DC-CIK联合化疗。两组一般情况比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。本临床试验的程序均经医院伦理委员会审查批准，全部受试患者均签署知情同意书。

1.2主要仪器与试剂 流式细胞仪FACS Calibur(美国BD公司);COBE Spectra血液成份分离机(美国 Gambro BCT公司);酶联免疫酶标仪(丹麦DenkeyDragon);Ficoll淋巴细胞分离液(美国Sigma公司);T淋巴细胞亚群检测试剂盒(古巴分子免疫学中心);抗人 IFN-γ、IL-2、IL-6 ELISA 试剂盒(上海森雄科技有限公司)。

1.3DC-CIK细胞培养 DC的体外诱导成熟：用血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，调整细胞密度为2×106ml-1，置于 37℃、5%CO2培养箱中培养 2 小时，将悬浮细胞移出，向培养瓶中加入 GM-CSF、IL-4，每2天换液 1次，并补充相关细胞因子，第6天加入 IFN-γ，诱导 DC成熟。

CIK细胞的体外诱导和扩增：以同样方法采集供者PBMC，用AIMV无血清培养基调整细胞浓度为4×106ml-1，置于37℃、5%CO2培养箱培养2小时。收集悬浮细胞，计数并用RPMI1640培养液调细胞浓度为1×106ml-1，第1天加入IFN-γ，24小时后加入CD3McAb及IL-2，每2天换液1次。

表1 两组临床资料情况比较Tab．1 The clinical data of two groups

DC和CIK共培养：第8天将收获成熟的DC与CIK细胞按照1∶10比例混合共培养6天。细胞培养第0天及每次收集细胞回输前取1 ml样品进行免疫表型检测。

1.4治疗方案 单纯化疗组：化疗方案：奥沙利铂130 mg/m2，静滴2小时滴完，第1天;CF 200 mg/m2，第2～6天;5-Fu 500 mg/m2，静滴4～6小时，第2～6天，21天为1周期，根据患者情况术后辅助化疗4～6个周期。

联合治疗组：患者行化疗前2天血细胞分离机单采外周血单个核细胞，培养 DC-CIK细胞。第3天起开始行化疗。细胞培养第13天时，经细菌、真菌及内毒素检测阴性后收集细胞，将收集的细胞用无菌生理盐水洗涤3次后混悬于含2%白蛋白的200 ml生理盐水中，于第14～16天连续回输3天，1次/天，每次1.5小时内回输完毕，共接受2个疗程DC-CIK细胞治疗。

1.5T细胞亚群及细胞因子水平测定 抽取两组患者治疗前后外周血，应用流式细胞术检测T细胞亚群中 CD3+、CD4+、CD8+、CD16+CD56+效应细胞的比例及CD4+CD25+调节性T细胞比例。ELISA法检测细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6的表达水平，按试剂盒说明书操作。

1.6疗效评定指标 治疗期间定期复查血常规、肝肾功能、肿瘤标志物及结肠镜、腹部B超、螺旋CT，必要时行PET-CT检查以了解肿瘤复发、转移等情况。随访两组患者的局部复发率、生存率。通过测定T细胞亚群及细胞因子水平，评估机体免疫功能的改善情况。比较两组患者周围神经毒性、骨髓抑制、胃肠道反应发生率，毒性反应按 WHO(1998)统一标准分为0～Ⅳ度。观察每次输注DC-CIK细胞过程中及回输后患者有无发热、过敏等不良反应。

1.7统计学分析 数据以±s表示，采用SPSS17.0统计软件包，进行t检验，率的比较采用χ2检验，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1比较治疗后局部复发率、生存率 单纯化疗组随访20例，联合治疗组随访20例，化疗组局部复发率高于联合组，有统计学差异(P＜0.05)，而1、2年生存率低于联合治疗组，比较无明显差异(P＞0.05见表2。

2.2治疗前后对患者外周血T细胞亚群的影响两组患者治疗前后外周血T细胞亚群的变化如表3所示，其中化疗组治疗后外周血 CD3+、CD4+、CD16+CD56+效应细胞和CD4+CD25+调节性T细胞有变化但无显著差异(P＞0.05)，CD8+效应细胞比例升高，CD4+/CD8+比值下降(P＜0.05);而联合组治疗后外周血CD4+(见图1)，CD16+CD56+效应细胞的比例(见图2)和CD4+/CD8+比值显著升高(P＜0.05)，CD8+效应细胞比例下降但无显著差异(P＞0.05)，CD4+CD25+调节性T细胞比例显著下降(见图3，P＜0.05)。

2.3治疗前后对患者细胞因子的影响 如实验结果(表4)示，化疗组治疗后IL-6升高(P＜0.05)，IFN-γ、IL-2降低，但无显著差异。联合组治疗后IFN-γ较治疗前显著升高(P＜0.05)，IL-2和 IL-6变化无明显差异。

2.4DC-CIK联合化疗的安全性评价 两组患者治疗后相关毒性反应主要为周围神经毒性、骨髓抑制、胃肠道反应。Ⅰ～Ⅱ度周围神经毒性，主要表现为感觉迟钝和(或)感觉异常(可逆转);Ⅰ～Ⅱ度胃肠道反应主要表现为恶心、呕吐(可控制)。联合组发生率低于化疗组(P＜0.05)。骨髓抑制以Ⅰ～Ⅱ度白细胞减少为主，应用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)后可继续完成治疗。化疗组和联合组发生率无显著差异(P＞0.05，见图4)。在 DC-CIK细胞回输过程中及回输后，仅1例患者出现发热，体温38.2℃，持续时间约3～5小时，经对症处理后缓解;未观察到胸闷、低血压、过敏、休克等不良反应，未出现明显肝肾功能、凝血功能受损。

图1 DC-CIK联合治疗前后外周血CD4+T细胞比例Fig．1 The ratios of CD4+cells in combined therapy group before and after therapy

图2 DC-CIK联合治疗前后外周血NK细胞比例Fig．2 The ratios of CD16+CD56+cells in combined therapy group before and after therapy

表2 两组患者治疗结束后随访复发、生存情况(%)Tab．2 The rate of recurrence and survival of two groups(%)

表3 两组患者治疗前后T细胞亚群变化(x ± s，%)Tab．3 Changes of T cell subsets of two groups(x ± s，%)

图3 DC-CIK联合治疗前后外周血调节性T细胞比例Fig．3 The ratios of CD4+CD25+cells in combined therapy group before and after therapy

表4 两组患者治疗前后细胞因子变化(x ± s，ng/L)Tab．4 Changes of intra-cellular cytokines of two groups(x ± s，ng/L)

3 讨论

结肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，术后辅助化疗对控制局部复发转移有显著作用，但化疗药物只能杀灭一定比例的肿瘤细胞，很难清除微小残留病变，最终需联合免疫治疗进一步提高疗效。

结肠癌患者的免疫功能常呈现抑制状态，免疫功能越低，越会发生“免疫漂移”(Immune shift)改变［2］，即Th1/Th2平衡失调并向 Th2转化，严重影响机体的抗肿瘤能力。成熟T细胞属异质性群体，两个主要亚群，即辅助性T细胞(Th)CD4+和抑制性细胞(Ts)CD8+，CD4+Th细胞根据其分泌细胞因子的不同，分为Th0、Th1、Th2三个亚型。Th0细胞是未成熟的前体细胞，向 Th1、Th2细胞分化。Th1细胞主要分泌 IL-2、干扰素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)和肿瘤坏死因子α、β(Tumor necrosis factor-α、β，TNF-α、β)，而 Th2 细胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10。近年来又报道了 Th3 亚型［3］，可大量分泌TNF-β、IL-4和IL-10，下调APC及Th1细胞活性，诱导免疫耐受。

CD3存在于所有T细胞表面，可反映CD4+和CD8+T细胞的总体水平。CD4+Th细胞介导细胞毒有关的免疫应答，促进B细胞增殖、分化及产生抗体。一般认为，肿瘤患者外周血的CD8+细胞主要是抑制性T细胞。CD4+/CD8+比值可作为判断机体免疫功能状态的一项重要指标。结肠癌患者CD4+/CD8+比值变小，表明机体免疫功能低下，可能与肿瘤细胞分泌免疫抑制因子，诱导CD8+的产生，同时阻止 CD4+的形成和成熟［4］，降低机体抗肿瘤免疫有关。CD4+CD25+调节性T细胞作为免疫抑制细胞，参与肿瘤的免疫逃逸，抑制 CD4+和CD8+T细胞的增殖和活化［5］。肿瘤患者外周血、肿瘤浸润淋巴结调节性T细胞比例升高。NK细胞的特征性表型主要是CD16+CD56+，是机体免疫监视系统的重要组成成份，NK细胞数量减少减弱了机体的免疫机能。

图4 两组患者毒性反应发生率(%)Fig．4 Incidence of side effects of two groups(%)

研究表明，化疗药物诱导的调亡肿瘤细胞能有效诱发免疫应答，对随后的免疫治疗起到增益作用［6］。Marten等［7］发现将同源 DC 和 CIK 细胞共培养后，DC和CIK细胞的增殖能力及CIK细胞的杀伤活性均明显增强。树突状细胞刺激初始T细胞(naive T cells)活化增殖，诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞成熟［8］。绝大多数肿瘤患者存在DC数量减少和功能障碍，提示体外诱导足够数量的功能强大的DC用于纠正患者的免疫缺陷成为一种可能。CIK可特异地聚集于肿瘤局部发挥靶向抗肿瘤作用;分泌大量的 Th1 类细胞因子［9］，如 IFN-γ、IL-2及IL-12，促进肿瘤细胞对CIK杀伤作用的敏感性;还能分泌IL-6、TNF-α及GM-CSF等细胞因子，增强细胞毒作用。大量研究表明，DC与CIK细胞共同培养后，DC的抗原提呈及激发机体免疫应答的能力提高，CIK的增殖活性和细胞毒作用增强［10］。

本文基于对单纯化疗与DC-CIK联合化疗治疗Ⅱ、Ⅲ期结肠癌同期对照研究，治疗前两组患者临床资料无显著差异，治疗后化疗组局部复发率高于联合组，而1、2年生存率低于联合组，无明显差异，可能是因为病例数较少，随访时间较短，有待今后扩大样本量进一步随访获得相应临床数据。应敏刚等［11］对Ⅰ～Ⅲ期结肠癌术后患者进行了相关研究，DC-CIK联合组和对照组中位生存期分别为63个月(95%CI，55～72)、52个月(95%CI，42～62)，Kaplan-Meier生存曲线和Logrank test检验结果表明，联合组生存期明显长于对照组(P＜0.05)。因此，联合DC-CIK可降低局部复发率，有可能提高患者的生存率，延长生存期。

从两组患者治疗前后T细胞亚群检测结果看，联合组治疗后外周血CD4+/CD8+比值升高，CD4+CD25+调节性T细胞比例下降，说明联合治疗可使结肠癌患者免疫功能得以恢复与提高，进一步杀伤化疗后那些残存的肿瘤细胞。Th1细胞分泌的IFN-γ可抑制Th2细胞增殖，Th2细胞分泌的IL-6可下调Th1细胞的活性，导致免疫障碍。新近研究显示，DC-CIK 联合治疗可增加 IFN-γ 的表达［12］。本研究与此研究结果一致。DC与CIK细胞共培养后，DC与CIK细胞均被进一步激活，IL-2、IFN-γ分泌显著升高，增加抗肿瘤效应。

此外，联合组患者Ⅰ～Ⅱ度周围神经毒性、胃肠道反应发生率较化疗组明显降低，并在免疫细胞回输过程中仅1例患者出现发热，未发现其他不良反应。因此，DC-CIK联合化疗治疗结肠癌是安全有效的，不仅活化了体内T细胞，增强了肿瘤杀伤力，同时下调了CD4+CD25+调节性T细胞的免疫抑制性，破坏了肿瘤复发、转移的内环境，提高机体整体免疫功能，有良好的应用价值和治疗前景。

1 Qi-Jing Wang，Hui Wang，Ke Pan et al．Comparative study on antitumor immune response of autologous cytokine-induced killer(CIK)cells，dendritic cells-CIK(DC-CIK)，and semi-allogeneic DC-CIK［J］.Chin J Cancer，2010;29(7)：641-647.

2 Yang P，Qiu G，Wang S et al．The mutations of Th1 cell-specific T-box transcription factor may be associated with a predominant Th2 phenotype in gastric cancers［J］.Int J Immunogenet，2010;37(2)：111-115.

3 Lahdenperä A，Ludvigsson J，Fälth-Magnusson K et al．The effect of gluten-free diet on Th1-Th2-Th3-associated intestinal immune responses in celiac disease［J］.Scand J Gastroenterol，2011;46(5)：538-549.

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5 Larmonier N，Fraszczak J，Lakomy D et al．Killer dendritic cells and their potential for cancer immunotherapy［J］.Cancer Immunol Immunother，2010;59：1-11.

6 Pei Zhou，Ping Liang，Baowei dong et al．Phase I clinical study of combination therapy with microwave ablation and cellular immunotherapy in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Biology ＆ Therapy，2011;11(5)，450-456.

7 Marten A，Renoth S，von Lilienfeld-Toal M et al．Enhanced lytic activity of cytokine induced-killer cells against multiple myeloma cells after co-culture with idiotype-pulsed dendritic cells［J］.Haematologica，2001;86(10)：1029-1037.

8 Topalian S L，Weiner G J，Pardoll D M.Cancer immunotheraphy comes of age［J］.J Clin Oncol，2011;29(36)：4828-536.

9 Franceschetti M，Pievani A，Borleri G et al．Cytokine-induced killer cells are terminally differentiated activated CD8 cytotoxic T-EMRA lymphocytes［J］.Exp Hematol，2009;37：616-628.

10 张 丹，何剪太.DC-CIK细胞协同索拉菲尼对肝癌细胞的杀伤作用［J］.细胞与分子免疫学杂志，2011;27(6)：664-667.

11 应敏刚，魏植强，杨建伟 et al.结直肠癌术后放化疗联合DCCIK 的疗效分析［J］.实用癌症杂志，2010;25(3)：274-277.

12 Wang Q J，Wang H，Pan K et al．Comparative study on anti-tumor immune response of autologous cytokine-induced killer(CIK)cells，dendritic cells-CIK(DC-CIK)，and semi-alogeneic DC-CIK［J］.Chin J Cancer，2010;29(7)：641-648.