方艳秋 刘 磊 谭 岩 蒋永兴 (吉林省人民医院医学诊治实验中心，长春130021)

靶向基因治疗被认为是一种有效的肝癌治疗研究手段［1］。瘤体组织内的乏氧改变，为肝癌基因治疗提供了理想靶点。位于HIF-1α(Hypoxia inducible factor-1 alpha)分子中有一段含有200多个氨基酸残基的氧依赖降解结构域(Oxygen dependent degradation domain，ODDD)可以有效的感受组织环境中的氧含量，调控与之相连的蛋白乏氧靶向性特异表达［2］。本实验将构建含有ODDD序列的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpeslsimplex virus-thymidine kinase，HSV1-TK)自杀基因表达载体，体外研究其对肝癌细胞株SMMC7721和HepG2的杀伤作用，探讨ODDD调控HSV1-TK基因乏氧靶向治疗肝癌的可行性。

1 材料与方法

1.1仪器和实验材料 肝癌细胞株SMMC7721、HepG2由本实验室传代培养;质粒pEGFP-ODDD为本实验室构建并保存。携带HSV1-TK的质粒pHSV106为Gibco/BRL公司产品。二甲亚砜(DMSO)为Sigma公司产品;噻唑蓝(MTT液)为Sigma公司产品。250 mg MTT溶于50 ml PBS(0.01 mol/L，pH7.4)中，0.22 μm微孔滤器除菌，分装，4℃保存。更昔洛韦(GCV)，分子量为255，美国 Sigma公司产品。

1.2实验方法

1.2.1pEGFP-TK和pEGFP-TK-ODDD表达载体的构建 参照本研究组前期工作［3］。

1.2.2质粒转染SMMC7721细胞和HepG2细胞

将处于对数生长期的SMMC7721细胞和HepG2细胞分别接种于24孔板，接种数量为5×104/孔，37℃，5%CO2培养箱中培养24小时。24小时后待细胞90%融合时用LipofectamineTM2000分别转染pEGFP-TK和pEGFP-TK-ODDD质粒。流式细胞仪检测转染质粒细胞48小时EGFP表达强度。

1.2.3MTT法检测HSV1-TK/GCV系统对肝癌细胞的体外杀伤效应 细胞转染后4小时将培养液换为含10%血清的IMDM培养液。细胞分为6组：A.常氧未转染组;B.常氧转染pEGFP-TK组;C.常氧转染pEGFP-TK-ODDD组;D.乏氧未转染组;E.乏氧转染pEGFP-TK组;F.乏氧转染pEGFP-TK-ODDD组。与实验各组平行设立只加培养液不加细胞作为空白对照，每组又分为不同GCV浓度亚组(mg/L)：0、12.5、25、50、100、200 和 400。更换培养液后 D 组、F组、E组放入乏氧环境中(三气培养箱含1%O2，5%CO2和N2平衡气)。细胞继续培养24小时后将原培养液弃去，加入含有不同浓度GCV的完全培养液，每个浓度设3个复孔，以不加GCV的细胞作为阴性对照。24小时后换为不含GCV的完全培养液。继续培养 24 小时后加入 200 μl/孔 MTT 液(300 μl/ml)，温浴4小时后，弃上清，每孔加入DMSO 200 μl，作用30分钟并轻微振荡后，使结晶物充分溶解。将100 μl上清液加入到96孔培养板中，空白对照调零，于波长540 nm酶标仪检测吸光度值(A值)。细胞存活率(%)=(处理组平均A值/阴性对照组A值)×100%。上述实验重复3次。

1.3统计学分析 统计学分析的计量资料数据以±s表示，两组间参数比较采用t检验，多组间数据采用方差分析，采用SPSS10.0统计软件包进行统计处理。

2 结果

2.1自杀基因载体细胞转染效率 1 μl Lipofectam ineTM2000分别和4 μg pEGFP-TK-ODDD质粒混合后转染SMMC7721和HepG2细胞48小时后，流式细胞术检测 EGFP表达。结果显示：根据对SMMC7721细胞和HepG2细胞EGFP表达量分析，细胞pEGFP-TK质粒转染率分别为33.23%和36.97%，见图1。

2.2肿瘤细胞对前体药物GCV敏感性 应用不同浓度GCV加入培养相同细胞数目的未转染的SMMC7721和 HepG2细胞作用24小时后，经过MTT方法检测，SMMC7721和HepG2细胞在常氧及乏氧环境下各组吸光值(如表1)。应用公式计算获得细胞的生存率，发现在GCV＜50 mg/L时，GCV对未转染细胞无杀伤作用，不会产生对系统的毒性作用。随着GCV浓度增大，细胞存活率逐渐下降，GCV＞100 mg/L时，GCV对细胞有毒性作用(P＜0.05)，这种毒性作用与环境中的氧浓度无关。

图1 流式细胞术检测质粒pEGFP-TK细胞转染效率Fig．1 Flow cytometric analysis for transfection rate of pEGFP-TK in cells

表1 GCV对肿瘤细胞增殖的影响(n=3)Tab．1 The sensitivity of cells to GCV(n=3)

图2 HSV1-TK/GCV对转染质粒pEGFP-TK细胞的杀伤作用(n=3)Fig．2 The effect of GCV on growth of SMMC7721 cells and HepG2 cells transfected by the plasmid of pEGFP-TK(n=3)

2.3GCV对转染pEGFP-TK质粒肿瘤细胞的体外杀伤效应 转染pEGFP-TK质粒后，随着GCV浓度的升高，细胞存活率逐渐降低，细胞对GCV的敏感性呈剂量依赖性(P＜0.05，图2)。在相同GCV浓度，乏氧时转染细胞存活率高于常氧时转染细胞存活率，但无统计学差异(P＞0.05)，提示乏氧可能降低肿瘤细胞对GCV代谢物的敏感性，但对于HSV1-TK/GCV对肿瘤的杀伤作用影响不显著。

2.4ODDD调节HSV1-TK/GCV对乏氧肿瘤细胞的靶向性杀伤作用 GCV处理转染pEGFP-TKODDD细胞24小时后，无论是SMMC7721细胞还是HepG2细胞，乏氧组细胞存活率较常氧组对照均显著下降，统计学处理有显著性差异，各组均P＜0.05(图3)。提示ODDD结构域能感受细胞内氧浓度的变化，正常氧环境下使TK蛋白降解，从而减少对GCV的催化作用，降低了对肿瘤细胞的杀伤作用;而在乏氧组，TK蛋白可以稳定存在发挥生物活性，最终导致肿瘤细胞存活率随着GCV浓度的升高而逐渐降低。

3 讨论

乏氧是实体肿瘤发展过程中的普遍现象，影响肿瘤细胞的很多基因转录活性发生改变。肝癌细胞组织内缺氧尤为显著，肝内正常的血供系统的破坏和肝脏肿瘤细胞的高度增殖是引起肝癌组织内严重缺氧的重要原因［4］。肝癌微环境的乏氧是导致肝癌化疗耐药的重要原因，多年来人们一直在研究克服肿瘤乏氧的方法，各种疗法虽然在不同程度上改善了肿瘤的乏氧现象，但都未能在临床中得到广泛的应用。基因治疗被认为是最有前景的肿瘤治疗方法，从1989年开始应用于临床至今已经有超过200多个有关肿瘤基因治疗的临床试验［5］。靶向性一直是基因治疗领域研究的重点和难点，载体的不专一不但降低了靶基因对肿瘤细胞的杀伤效应，同时还可能会误杀非靶器官或肿瘤以外部位，造成副作用［6］。

图3 GCV对转染pEGFP-TK-ODDD质粒肿瘤细胞增殖的影响(n=3)Fig．3 The effect of GCV on growth of SMMC7721 cells and HepG2 cells transfected by the plasmid of pEGFP-TK-ODDD(n=3)

以HSV1-TK/GCV系统为代表的自杀基因疗法可以实现选择性原位转导和特异性杀伤的优点，从而使其较早获得美国国立卫生研究院(NIH)和重组DNA顾问委员会(RAC)的批准而应用于临床［6］。本研究选用了两种研究中比较常见的肝癌细胞株SMMC7721和HepG2作为靶细胞来探讨HSV1-TK/GCV系统对肿瘤细胞的杀伤作用。结果显示，在转染效率基本相同的情况下，GCV浓度为12.5 mg/L时，转染 pEGFP-TK质粒的 SMMC7721细胞和HepG2细胞的存活率为64.21%和57.41%，均低于未转染肿瘤细胞的存活率，说明转染了pEGFP-TK质粒的细胞能够有效的将前体药物GCV转换为对细胞有毒性的药物，发挥对肝癌细胞株SMMC7721和HepG2的杀伤作用，HSV1-TK/GCV系统对肿瘤的杀伤作用具有普遍性。

目前限制自杀基因疗法临床应用主要原因之一是高剂量的GCV对机体可能产生严重的毒副反应。研究发现GCV浓度大于1 mmol/L即可产生对细胞毒性作用［7］。本研究也证实，在乏氧及正常氧环境下，低浓度GCV(＜50 mg/L)对SMMC7721细胞和HepG2细胞的存活率无明显影响，细胞存活率几乎为100%;随着GCV浓度增大，细胞存活率下降，在GCV浓度400 mg/L时，细胞的存活率降到70%左右(SMMC7721细胞和HepG2细胞的存活率分别68.46%和71.35%)，说明高浓度GCV(＞100 mg/L)时在常氧和乏氧环境下均可以产生对细胞的毒性作用，可能会在临床应用中产生对系统的非靶向性伤害。

以乏氧为靶点的肿瘤基因疗法被证实可以有效的发挥杀伤肿瘤的同时，还可以显著的降低基因疫苗对机体的损伤毒性作用［8，9］。ODDD是调控HIF-1α分子在乏氧环境中特异性发挥生物学活性的重要结构域，研究进一步证实含有ODDD结构域的重组蛋白可以在乏氧环境下特异的表达并发挥生物学效应［10］。本研究的目的就是将ODDD结构域对乏氧的特异性应答效应应用到调控HSV1-TK/GCV系统中，利用肿瘤乏氧的特异性病理改变使TK基因在肿瘤细胞中特异表达，靶向杀伤肝癌细胞。实验结果显示，转染含有相同浓度GCV作用后，乏氧环境下SMMC7721细胞和HepG2细胞的存活率显著低于正常氧环境中的肿瘤细胞(见结果2.4，P＜0.05)。提示乏氧环境下细胞中的HSV1-TK基因可以稳定表达发挥对前体药物GCV的催化作用，使其转化为对肿瘤细胞有杀伤作用的药物。而在正常氧环境下，ODDD可以感应细胞内氧水平，诱导HSV1-TK蛋白特异性的降解，使其不能有效发挥其生物效应，ODDD介导的自杀基因靶向性杀伤研究为肝癌的基因治疗研究提供了新的研究方法。

1 Sangro B，Prieto J.Gene therapy for liver cancer：clinical experience and future prospects［J］.Curr Opin Mol Ther，2010;12(5)：561-569.

2 Min J H，Yang H，Ivan M et al.Structure of an HIF-1alpha-pVHL complex：hydroxyproline recognition in signaling ［J］.Science，2002;296(5574)：1886-1889.

3 刘 磊，方艳秋，许淑芬et al.ODDD调节HSV-HSV1-TK/GCV对乏氧环境宫颈癌Hela细胞特异杀伤伤作用的研究［J］.中国妇幼保健，2008;23(9)：1278-1281

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6 Greco O，Folkes L K，Wardman P et al.Development of a novel enzyme prodrug combination for gene therapy of cancer：horseradish peroxidase/indole-3-acetic acid［J］.Cancer Gene Ther，2000;7(11)：1414-1420.

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9 李 玲，邢力刚，于金明.肿瘤乏氧靶向基因治疗研究进展［J］.国外医学·肿瘤学分册，2004;5(31)：352-355.

10 Harada H，Hiraoka M，Kizaka-Kondoh S.Antitumor effect of TAT-oxygen-dependent degradation-caspase-3 fusion protein specifically stabilized and activated in hypoxic tumor cells［J］.Cancer Res，2002;62(7)：2013-2018.