王 华 刘 俊 戴东方 管贤伟 丁 杰 邵世和 (江苏大学基础医学与医学技术学院，镇江212013)

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H．pylori)是人类常见的致病菌之一，是慢性活动性胃炎、消化性溃疡等胃部疾患的主要病因，并且与胃癌的发生密切相关，被WHO列为Ⅰ类致癌原。近年来的统计数字表明胃癌是全球的第四大肿瘤，而且在由癌症导致的死亡中位居第二［1］。

已证实，高致病性的H．pylori菌株都含有一长度为40 kb的致病岛(Cag-PAI)，编码CagA(细胞毒素相关基因A蛋白)在内的27～31个与毒素及毒素装配和分泌功能相关的蛋白。CagA是H．pylori最主要的致病因子［2］，此蛋白是通过致病岛编码的由多个蛋白组成的Ⅳ型分泌系统转运进入宿主细胞的［3］，之后在细胞内的特定部位被磷酸化，干扰细胞内信号传导［4，5］，诱导炎症反应的发生及胃癌的产生［6］。然而，关于负责CagA蛋白转运的分泌系统的研究较少，其转运机制也尚未明确。

本研究选择H．pyloriⅣ型分泌系统中的cagL基因为研究对象，采用同源重组的方法，构建cagL基因缺失的自杀质粒，电击转化H．pylori，通过抗性基因成功地筛选出了目的基因的缺失株，并分析基因缺失前后，CagA蛋白转运功能的变化，为揭示Ⅳ型分泌系统中cagL基因在CagA转运中的作用，以及更深入地认识H．pylori的致病机制与完善Ⅳ型分泌系统的结构都极有必要。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株、质粒和细胞 H．pylori NCTC11637由中国疾病控制中心张建中教授馈赠，大肠埃希菌

①本文受镇江市2008年度第四批科技计划(社会发展)项目资助(SH2008031)

②江苏大学附属江滨医院，镇江212000

1.1.2主要试剂及仪器 哥伦比亚培养基、微需氧产气袋购自OXOID公司Ex TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶 EcoRI、KpnI、BamHI及 XhoI、T4-DNA连接酶、DL2000 DNA marker及蛋白质分子量标准(低)购自TaKaRa公司;高糖DMEM培养基及胰蛋白酶购自GibcoBRL公司;小牛血清购自上海华美生物公司;CagA蛋白单克隆抗体、细胞裂解液RIPA购自 Santa Cruz公司;β-actin内参抗体，ECL购自碧云天公司;其他常规试剂按照分子克隆实验指南配制。

1.2自杀质粒同源臂的扩增 根据GenBank公布的H．pylori全基因组序列，在cagL基因ORF的上游和下游设计两个同源臂F1和F2的引物(如表1)。cagL基因全长739 bp;P1/P2/P3/P4分别为两同源臂上下游特异性引物，扩增后获得用于构建自杀质粒的同源臂F1和F2片段。引物由上海英俊生物公司合成。以H．pylori NCTC11637菌株基因组DNA为模板，用ExTap聚合酶进行PCR扩增：条件为：94℃ 5分钟，94℃ 45秒、55℃ 45秒、72℃ 50秒，30个循环，72℃ 10分钟;PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，GeNius凝胶电泳图像分析系统分析鉴定并用胶回收试剂盒回收PCR产物。

1.3自杀质粒pBluescript/△cagL：KMr的构建 取cagL F1及F2的PCR胶回收产物分别与pMD18-2T用T4-DNA连接酶4℃连接过夜。连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞。转化后的细菌涂布于含50 μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12小时。挑取菌落转种于终浓度为50 μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振摇10小时，用碱裂解法进行质粒提取，并进行酶切鉴定。胶回收同源臂片段F1、F2，分两步将F1、F2与载体pBlueKM40连接，将连接产物转化感受态细菌E．coli DH5a，转化好的细菌涂布终浓度为100 μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基上培养12～16小时，挑选单菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，置37℃摇床振荡培养10小时，抽提质粒，酶切鉴定。

表1 构建cagL基因缺失引物列表Tab．1 Primers designed for the deletion of cagL

1.4cagL基因缺失株的构建与鉴定 从培养18～24小时的哥伦比亚培养基上刮 H．pylori(1010CFUP/ml)，10%甘油-蔗糖溶液洗涤，4℃ 5 000 r/min离心5分钟，沉淀重悬于100 μl甘油-蔗糖溶液，4℃放置10分钟，加自杀质粒25 μg，混匀，移入冰预冷的电击杯，冰浴5分钟后置于电穿孔架上，电击条件：25F，2.5 kV，200 Ω 5 秒，电击后用 SOC 缓冲液20倍稀释H．pylori，涂布于25 mg/L卡那霉素的血平板上，37℃微需氧条件，培养72小时，收取细菌。

收获细菌经尿素酶以及细菌染色鉴定后，以野生株NCTC 11637为对照，用扩增上游片段F1的上游引物P1和下游片段F2的下游引物P4进行菌液PCR鉴定，扩增条件为：94℃ 10分钟，94℃ 50秒、55℃ 50秒、72℃ 2.5分钟，35个循环，72℃ 10分钟。扩增产物送上海英骏生物工程公司测序鉴定无误后，将突变株命名为ΔhpcagL。

1.5CagA蛋白转运实验 胃上皮细胞GES-1常规培养2～3天后，按照MOI=300∶1比例加入新鲜培养的野生型和缺失株ΔhpcagL;在5%CO2培养条件下作用4小时;PBS洗涤3次后，收集细胞重悬于Western blot细胞裂解液中。

取裂解后的蛋白进行SDS-PAGE电泳后，然后4℃电转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭1小时，换新鲜的封闭液，加入一抗(CagA单克隆抗体)，4℃孵育过夜。1×TBST洗涤3次，每次10分钟，于1×TBST中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠IgG作为二抗，37℃ 摇床反应1小时，最后ECL显色。同时以β-actin蛋白为内参。

2 结果

2.1cagL基因缺失自杀质粒的构建 将构建cagL基因缺失株的自杀质粒pBluescript/△cagL：：KMr连接好后，进行酶切鉴定，结果显示：经KpnⅠ、XhoⅠ酶切，电泳图下方出现约为651 bp片段(F1);经EcoRⅠ、BamHⅠ 酶切，电泳图下方出现约666 bp片段(F2);与设计结果完全相符(图1)。

图1 自杀质粒pBluescript/△cagL::KMr的酶切鉴定Fig．1 Identification of pBluescript/△cagL::KMrby restricted endonuclease enzyme

2.2cagL基因缺失株的鉴定 用引物P1和P4对筛选获得的缺失株进行PCR鉴定。结果显示，野生型经PCR扩增后获得了一大小约为2 kb的片段，而cagL基因缺失株，则获得了一约2.5 kb大小片段，与理论设计相符(图2)。测序结果进一步证实cagL基因同源重组的成功。

2.3cagL基因缺失前后对CagA蛋白转运能力的影响 将野生型和cagL基因缺失株，分别与GES-1细胞共培养;细胞裂解后进行Western blot分析;结果表明(图3)，H．pylori野生型和 cagL基因缺失株，均未能检测到CagA蛋白，cagL基因缺失能导致CagA蛋白转运功能丧失。

3 讨论

H．pylori在世界上分布广泛，是慢性活动性胃炎的病原体，其感染是消化性溃疡、胃癌和胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的重要危险因素［7，8］。来自世界各地的流行病学研究证实，幽门螺杆菌感染与胃癌有关，CagA蛋白被认为是一种潜在的癌蛋白，在致癌过程中可能发挥重要作用［9］。该蛋白可借助IV分泌系统直接进入胃上皮细胞，然而，关于负责CagA 蛋白转运的分泌系统及其转运装置相关基因的报道较少。

图2 cagL基因缺失株的鉴定Fig．2 Identification of cagL deletion mutant

图3 Western blot法检测CagA转运能力Fig．3 The ability of translocation of CagA via Western blot method

目前，对 CagF/HP0543、CagD/HP0545等基因的功能作了一些初步的研究。基因缺失研究表明CagZ对于CagA转运是必须的，但对于IL-8的诱导并不产生显著的影响，而CagN、CagG、CagF、CagD对CagA的转运与IL-8的诱导都是必须的，可能这几种蛋白可稳定Ⅳ型分泌系统的结构的功能［10］;尚有报道指出 CagI(HP0540)、CagA的 N端及 CagY(HP0527)的 C端，均与整合素 β1具有相互作用［11］;CagF可以识别CagA蛋白的C端区域，辅助其转运，可能参与CagA蛋白的募集作用［12］;CagD蛋白的折叠方式与SycT这种分子伴侣似，SycT是小肠结肠炎耶尔森菌Ⅲ型分泌系统蛋白［13］，因此，CagD可能是一个多功能的Ⅳ型分泌系统蛋白，不仅与CagA转运有关，而且也能分泌到细菌外，促进对宿主细胞的一种附加作用［14］。

本研究利用同源重组原理，构建了cagL基因的缺失株，并比较该基因缺失前后对效应蛋白CagA转运功能的影响。研究选用克隆质粒pBluescript SKⅡ(-)来构建载体，该载体在多克隆位点处插入一个卡那霉素抗性基因盒，采用PCR方法扩增cagL基因编码区(ORF)两侧区域的基因片段(F1)(651 bp)和(F2)(666 bp)，以二者作为同源重组的同源臂片段。然后采用电穿孔技术将重组载体转化进入野生株NCTC11637菌体内，载体与野生株染色体之间发生同源重组，使卡那抗性基因置换野生株的cagL基因，因此，cagL基因敲除的突变株pBluescript/△cagL：：KMr得以建立，并用PCR方法鉴定其缺失株，为进一步研究cagL基因的功能奠定基础。最后本文将H．pylori野生型及缺失株，与正常胃上皮细胞GES-1进行共培养后检测了CagA蛋白的转运能力，Western blot的结果显示cagL基因敲除后，CagA蛋白转运功能丧失，说明cagL对CagA蛋白的转运是必不可少的，是CagA蛋白转运系统中重要组成成分之一，为深入研究cagL基因的功能奠定基础。

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