黄霏霏 张朝然

随着人类基因组计划的完成，蛋白质组学已悄然成为后基因时代的研究热点。与基因组相比，生物体的复杂性及多样性更多的是由蛋白质决定，而传统的对单个蛋白质进行研究的方法已无法满足后基因组时代的要求，因此大规模、全方位的蛋白质研究势在必行，蛋白质组学也由此诞生。本文主要对基本概念、研究方法及其在眼表疾病的应用等方面的新进展进行综述。

1 蛋白质组学的背景和概念

蛋白质组是一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质，不仅包括基因转录产物直接翻译的蛋白质，还包括转录产物选择剪接后所编码的蛋白质以及翻译后修饰的蛋白质等。基因组对于生物体来说是相对恒定的［1］，是对生物功能的静态分析。而从基因到蛋白质还存在翻译调节以及翻译后的加工修饰等多个步骤，mRNA的水平与蛋白质的表达并不存在直接关系［2］。因此，要更好地了解机体各项机制，就必须对机体功能的直接执行者蛋白质进行深入的研究。1994年蛋白质组学(proteomics)的概念被首次提出，它是指从整体出发，研究动态变化的生物体所有蛋白质组成、表达和修饰状态等，分析蛋白质之间及其与药物之间的相互作用，更深刻地探索不同生理、病理状态下的生命活动规律［3］。

2 蛋白质组学的主要研究方法

蛋白质组学基本技术流程包括从生物样品中提取蛋白质，将蛋白混合物分离、染色，得到蛋白质表达谱;运用计算机图像处理技术对蛋白质进行定位、定量及差异点寻找;最后鉴定蛋白质种类及肽序列。目前，电泳技术与质谱技术联用是蛋白质组学研究中大规模自动化鉴定蛋白质组的主要手段。

二维电泳是蛋白质组学研究中的一个里程碑，也是目前常用的蛋白质分离技术［4］。通过将等电点电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳结合，依据等电点不同在第一相等电聚焦电泳分离蛋白质，接着再根据相对分子质量不同，在第二相十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质。质谱是依据分离出的蛋白质理化特性、肽段序列特征进行识别和鉴定蛋白质，敏感度高，通量高，准确性强，可自动化操作，且可用于翻译后修饰的分析。质谱分析的原理是通过测量质荷比(mass－to－charge ratio，M/Z)的差异来确定样品分子的质量，再在蛋白质数据库中查找对应的蛋白质［5］。目前常用的质谱技术包括:基质辅助激光解吸飞行时间质谱技术(matrix assisted laser desorption in ionation－time of flight－mass spectrometry，MALDI－TOF－MS)，电喷雾离子化质谱技术(electro－spray ionization mass spectrometry，ESI－MS)，表面增强激光解析/离子化飞行时间质谱(surface－enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI－TOFMS)，同位素标记相对和绝对定量技术(isobariCTag for relative and absolute quantitation，Itraq)等［6］。

3 眼表疾病的蛋白质组学研究

眼表包括角膜上皮、结膜上皮和泪膜3个部分。泪膜是覆盖于眼球表面的一层液体，对维持眼的正常结构、功能具有重要作用。泪膜和泪液中含有多种蛋白质，它们的异常表达常与眼表疾病相关联。de Souza等［7］运用蛋白质组学对泪液蛋白进行分析鉴定，结果显示在鉴定的491种蛋白中，包括64种蛋白酶或蛋白酶抑制物、18种抗氧化酶。这些蛋白酶不仅在保护眼表免受外界环境不良因素的损害方面发挥重要作用，其蛋白酶之间作用的平衡对维持眼表正常生理微环境也极其重要。因此，泪液中全部蛋白质的研究对于阐明眼部疾病的分子机制非常有用。

3.1 干眼症 干眼症是眼科的常见病、多发病，发病率为11%～22%［8］。目前将其定义为由于泪液生成不足或蒸发过强导致的泪膜不稳定和眼表损害，主要表现为眼部不适、视觉模糊［9］。临床上干眼症多采取泪液分泌试验、泪膜破裂时间等检查，但这些检查并不能很好阐明干眼症的发病机制及其病理生理过程。泪液的收集是无创性的。若能将收集的泪液进行相关蛋白质组的分析，无论是对发病机制的研究，还是临床诊断、治疗及疗效评估，都有非常重要的意义。

原发性 Sjögren 综合征(primary Sjögren Syndrome，p－SS)是引起泪液生成不足型干眼症的主要病因。目前导致泪腺分泌功能障碍的机制不明［10］，临床确诊时多为晚期。Tomosugi等［11］用 SELDI－TOF－MS 对 p－SS 患者的泪液蛋白进行分析，并寻找可信的生物标记物。结果发现与对照组相比，p－SS患者的泪液中有7种蛋白的峰值下降，3种上升。下调的蛋白包括溶菌酶和前白蛋白。对发生损害的眼表上皮进行虎红染色后发现，蛋白质峰值的下降程度与虎红染色评分呈负相关。该试验结果的特异性为100%，可以补偿传统检查出现假阴性的可能。SELDI－TOF－MS所需的样本少，且为非侵入性，提高了临床早期诊断p－SS的可行性。

泪液蒸发过强型干眼症是睑板腺功能异常及脂质缺乏导致的。Versura等［12］对中度蒸发型干眼症患者泪液中的蛋白质组进行分离，并用免疫印迹和酶谱分析对相应的蛋白质进行鉴定，结果发现多种与泪膜稳定性密切相关的蛋白质的量发生改变。在患者的泪液中，脂钙蛋白和亲脂蛋白含量降低，并且它们的实际水平与泪膜破裂时间及眼部的不适症状相关，提示这两种蛋白含量的减少可能导致泪膜稳定性变差。脂钙蛋白还可清除泪液中多余的脂质分子，它含量的降低会导致泪液中有害脂质增多。结膜血管通透性异常导致血清白蛋白渗入泪液，即便在早期患者的泪液中，白蛋白含量也已显著升高。Tong等［13］通过 iTRAQ技术发现，患者泪液中 S100A8蛋白与S100A9蛋白显著升高，它们的改变与睑板腺导管上皮角化有关，还反映了眼红、视力模糊等症状的程度。因此，进行泪液中蛋白质组分改变的相关研究，对于进一步阐明泪液蒸发过强型干眼症的发病机制有着重要意义。

糖尿病患者干眼症的发病率远高于正常人群，其严重性与糖尿病程度成正比［14］。Herber等［15］用二维电泳技术和矩阵分析法对2型糖尿病所致的干眼症患者泪液中蛋白组分进行分析，发现试验组泪液蛋白的种类和峰值均明显高于对照组。后者主要是由糖基化蛋白增加所致，如白蛋白的糖基化。蛋白质糖基化可改变蛋白质结构和功能，从而引起眼表疾病。泪液中蛋白质改变能否作为糖尿病并发干眼症的诊断手段?蛋白质的变化是由糖尿病本身引起还是由糖尿病性代谢紊乱激发导致?与其他眼表疾病相比发现糖尿病并发干眼症的相关特异蛋白，这些都是今后研究中亟待解决的问题。

3.2 圆锥角膜 圆锥角膜是角膜异常膨胀、增厚所致，多起病于青少年。传统观念认为圆锥角膜是一种非炎症性疾病，但近期研究［16］提示可能有炎性因子和免疫因素参与其发病机制。Pannebaker等［17］采集佩戴透气性角膜接触镜和未佩戴的圆锥角膜患者以及正常人的泪液，对3组泪液中蛋白质进行分析。结果发现圆锥角膜患者泪液中基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1，MMP1)升高。MMP1是一种可降解细胞外机制的酶，可以特异性破坏角膜胶原1和角膜胶原3。细胞骨架角蛋白含量也增高，提示圆锥角膜的形成可能与角膜病理性角化有关。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体1(tumor necrosis factorrelated apoptosis－inducing ligand 1，TRAIL－R1)的不恰当表达可能也与圆锥角膜存在相互关联。乳腺球蛋白B可与疏水性配体结合并参与泪膜脂质层的形成，它在圆锥角膜中的表达增高。Lema等［18］运用二维电泳和质谱技术，发现圆锥角膜患者泪液中锌－α2－糖蛋白(zinc－α2－glycoprotein，ZAG)、免疫球蛋白 κ恒定区(immunoglobulin kappa constant，IGKC)的表达均低于正常人。乳铁蛋白可以抑制前炎性因子(IL－6，TNF－α，IL－1－β，IL－8)和胶原酶的作用，是保护性因子。IGKC参与组成抗体的轻链，并与免疫应答相关。IGKC的改变提示圆锥角膜的发生可能有免疫因素参与。ZAG的作用目前尚不清楚。

3.3 结膜松弛症 结膜松弛症(conjunctivachalasis，CCH)是由于球结膜过度松弛造成球结膜堆积在眼球与下睑缘，引起一系列眼表不适，如刺激、疼痛、溢泪、干眼等。对CCH患者泪液进行蛋白质组的研究，对阐明发病机制及选择临床治疗手段都具有重要意义。Acera等［19］发现 CCH 患者泪液中mmP9、IL－1、IL－6等炎性因子表达均有升高，提示CCH的发生与炎症参与密切相关。进一步研究显示促进MMP9合成的S100－A4蛋白在CCH患者泪液中也有增加。此外，与细胞骨架合成、降解相关的蛋白，以及与纤维化相关的蛋白质在CCH中也均有上调［20］。

3.4 角膜移植排斥反应 角膜排斥反应是导致角膜移植失败的最主要原因。角膜本身无血管，其营养代谢主要来自房水、泪膜、角膜缘血管，因此角膜自身的变化与房水、泪膜及血液成分的改变必定密切相关。

Funding等［21］对急性角膜移植免疫排斥患者的房水进行研究，首先用Bradford法对房水中蛋白总量进行测定，再用二维电泳分离房水蛋白，接着用免疫印迹标记白蛋白，最后对剩下的房水蛋白采用MALDI－TOF－MS进行鉴定检验。结果显示共有31种标记蛋白明显上升，它们来源于白蛋白、α1－抗胰蛋白酶、载脂蛋白J、细胞角蛋白－II、丝氨酸蛋白酶抑制剂。进一步研究发现，角膜移植排斥反应中房水蛋白组成发生改变的机制至少有3点:①血－房水屏障的破坏导致血浆中白蛋白进入房水;②房水中发现的白蛋白片段提示房水中存在特异性水解白蛋白的酶类;③α1抗胰蛋白酶的增加是由移植角膜自身合成释放的，并非由于血－房水屏障破坏引起，它具有保护移植角膜免受免疫排斥反应的作用。

3.5 眼表重建 完整的角膜上皮细胞、角膜无血管、规则排列的基质胶原纤维共同保障角膜的透明性，角膜缘干细胞可维持角膜上皮的不断更新，同时防止角膜结膜化、新生血管长入等一系列影响角膜透明因素的发生［22］，而眼表化学伤、热灼伤等可破坏角膜缘干细胞功能。目前主要的治疗方法是进行角膜缘干细胞移植［23］。Echevarria等［24］运用蛋白质组学技术发现角膜缘基质中的玻璃黏蛋白对于维持角膜缘干细胞的活性有重要意义。Lyngholm等［25］在对角膜缘干细胞标志物的进一步研究中发现，仅在角膜缘基底细胞层中低分化的干细胞中存在超氧化物歧化酶2，此外，细胞角蛋白15也只存在于角膜缘基底细胞层中［25－26］。

目前一种新兴的眼表重建手段是通过生物工程技术使角膜缘干细胞在体外培养基上增殖后，再移植至眼表，而羊膜则是一种良好的基质。通过对培养角膜缘干细胞完整羊膜的蛋白组研究［27］显示，上调的热休克蛋白70－1可通过增加凋亡和ADP聚合酶裂解来促进干细胞增殖。Baharvand等［28］用MALDI－TOF－MS技术对去上皮的羊膜进行分析，结果发现人基膜聚糖和骨甘氨酸含量增加。它们参与调节胶原纤维的增殖，骨甘氨酸更与细胞增殖、血管生成、炎症反应等的调控相关，因此，去上皮的羊膜也为角膜缘干细胞的增殖和维持其正常表型提供了适合的微环境。

4 展望

近年来，蛋白质组学的研究呈现突飞猛进的发展，但关于眼部的研究并不多。部分原因是由于眼部结构精细、取样风险大，尤其在健康对照组内，很多诸如穿刺等操作可行性小。泪液位于眼表，其收集是无创的，可将损伤、感染及其他风险降至最低，被检者痛苦小，对操作者技术要求亦较小。泪液中含有多种蛋白，它们的变化与疾病的产生、发展密切相关，因此对于泪液蛋白质组的研究有着深远的意义。目前大部分蛋白质组的研究，是关于某种眼病或外伤、手术后相关组织的蛋白质变化;在今后的研究中，要更侧重于发现可以用于早期诊断的标记蛋白，发现新的分子通路和药物作用靶位点，为寻找新的早期诊断和治疗手段提供全新的依据。

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