杨宏方 孙兴怀

猴作为一种特殊实验动物，一方面，它与人同属灵长类，眼部结构、视觉中枢以及疾病进程与人类最为相似，和其他动物相比，研究结果也最易推广到人;另一方面，猴价格高昂，来源不易，故研究中慎重采用。在青光眼领域，已有数种动物造模方法，且研究人员在不断努力寻找稳定、有效的新方法，但由于猴的特殊性和珍贵性，用于猴的造模方法相对局限。本文就几种能够运用于猴的成熟青光眼造模方法作一总结，希望能为将来计划采用猴作为青光眼实验动物的同道提供参考，同时也希望在此基础上激发出更多关于猴青光眼造模方法的新思考。

猴的一个生命年相当于人类的3～3.5个生命年，不同种类猴子的眼球大小不一。目前用于制作青光眼模型的猴子有恒河猴(rhesus monkeys，Macaca mulatta)，食蟹猴(cynomolgus monkeys，Macaca fascicularis)，夜猴(owl monkeys，Aotus trivirgatus)，以及松鼠猴(squirrel monkeys，Saimiri sciurea)。其中，国际上报道较多的是恒河猴(年龄9～16岁)和食蟹猴(年龄6～12岁)。Nork等［1］研究发现，由于不同种类猴视网膜细胞的密度、数量、形态有差异，视觉电生理尤其是多焦视网膜点图检测的结果不同，以至于何种猴更适于作为研究对象，目前尚无定论。

1 慢性高眼压模型

1.1 激光光凝小梁网 1974年Gaasterland和Kupfer首先使用氩激光对恒河猴前房角小梁网区行重复全周光凝，产生类似于人类慢性开角型青光眼的表现。1983年Quigley和 Hohman对其方法进行改进，将猕猴全身麻醉后在房角镜下激光瞄准功能小梁网区进行击射，使击射区小梁组织发白或稍变黄，相邻2个击射点的烧灼斑相连续。如此行270～360°范围击射，导致初期小梁组织细胞崩解以及后续小梁组织的增殖及纤维化，瘢痕形成，部分功能性房角关闭，房水流出阻力增加，眼压波动性上升。该法简称“激光光凝法”，已成为比较理想的制造慢性高眼压模型的方法。

目前使用的激光主要有2种:氩激光(512 nm)和半导体泵浦固体倍频532激光。两者光凝的操作基本一致，不同之处在于具体参数。不同文献报道有所差异，我们综合各家之见后推荐采用参数如下:氩激光(512 nm)——光斑直径50～75μm，功率1000～1500 mW，时间 0.5～1.0 s，全房角光凝 80～250点，平均181点。若总能量=每次光凝时长×功率×光凝次数，则最终制模总能量平均达80～90 J［2］。倍频532激光——光斑直径50μm，功率1200～1500 mW，时间0.2 s，全房角光凝9～128点，平均124点［3］。两者相比，倍频532激光仪器小巧轻便，易于携带，光凝时间短，价格也低，有推广价值。

光凝后，房角镜下可见到房角区散在的色素堆积与发白区域相间。早期由于反应性的急性前葡萄膜炎，大部分眼会出现眼压暂时降低，可局部适当给予典必舒眼膏抑制炎症。数天到1周后眼压开始升高，升高范围为24～50mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)，可平均维持(21 ±15)个月［4］。文献报道期间不需要重复干预;但实际操作中我们［5］发现，光凝后眼压都会缓慢下降至正常，需补打激光。国内曾有文献［4］报道间隔2周行3次击射即可形成持续稳定的高眼压模型，若3次击射后无效则提示难以制成高眼压模型。

该法经久不衰，总结其优势:首先，具有非侵袭性，光凝导致的轻到中度炎症在2周内即消退;其次，相对于其他制模方法，眼内压波动较小;第三，随着视觉电生理检测在青光眼研究领域的广泛应用，此种造模方法保持屈光间质清晰，不对视觉电生理检查造成干扰。

但也有其缺点:①激光光凝造模后眼压常常超过所期望的升高范围(30～40mm Hg)，或有较大波动，尤其是当眼压波动过大达到阻断视网膜血供可能的时候，给最终视神经损伤的解释带来困难。为了避免这种情况，常使用眼局部降眼压药物将眼压控制在一定范围内。但有一个疑问:这些药物对于眼的微观结构以及要检测的分子生物学以及生化指标有无影响?②有报道激光可能导致眼球前段发生变化［4］，如虹膜周边与后部小梁网发生前粘连、角膜周围新生血管、虹膜萎缩、虹膜晶状体粘连、色素沉积于角膜内皮和晶状体表面等。③该制模方法对设备要求高，且操作者的操作经验很重要，激光击射不足则眼压不会升高，击射过量又易击穿小梁网，眼压不升反降。

1.2 前房注射外来物 据文献报道，自该法诞生以来，在啮齿类动物［6-7］中广泛采用，可用的外来物质有很多，如糜蛋白酶、甲基纤维素、复方卡波姆、乳胶微球、磁珠、透明质酸钠等。而国际上使用于猴的前房注射物有血影细胞和乳胶微球，血影细胞法由于各种缺陷正逐渐被淘汰，乳胶微球法则是后起之秀，且在逐步改进中，值得介绍。

乳胶微球法实施于猴的经典案例来自于Weber等［8］，他们将直径为10μm的无菌微球在磷酸盐缓冲液中制成混悬液，每周1次通过玻璃微管缓慢注射4×105微球/100 μL到猴的眼前房。微球质量轻，在前房内随房水而移动，大部分微球经小梁网进入Schlemm管，还有部分进入脉络膜上腔和角膜缘的房水流出管道;且微球聚集成为微球团后，能更好阻断小梁网房水通路。此外，外来物造成小梁网炎症，也会产生高眼压效应［9］。根据目标眼压和实时眼压的差值、前一次注射后眼部的反应等调整注射剂量重复注射，共注射8～12次开始出现眼压稳定升高，后续的注射可以使眼压升高维持1～3周。我们的实验结果与 Urcola［10］、Cone 等［7］报道一致，使用每周前房联合注射乳胶微球和羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethylcellulose，HPM)或10mg/mL透明质酸钠的方法，诱导眼压升高更快，最高眼压更高。

相对于激光光凝法，该法操作简单，可重复性强，炎症反应轻微。若注射剂量适宜，注射后24～48 h可达视轴清澈，方便观察眼底，监测疾病进程。多次注射后即使有微球黏附在虹膜表面，也不影响虹膜功能。增大注射的频率可以达到较高且较为平稳的眼压。眼压一旦升高，不易自行回落至正常，模型可保持18～144周［9］，这是其他方法都无法实现的。

该法存在的缺陷:①剂量或频率不当导致眼压大波动。分析其可能原因，微球首先阻塞小梁网，合并小梁网细胞炎症肿胀导致眼压升高，眼压增高又迫使Schlemm管内壁内皮细胞间紧密连接结构变得疏松、细胞旁间隙变大，微球进入这些间隙中后进一步扩张细胞旁通道，房水经此通道流出增多，眼压下降，直至再次注入乳胶微球。②在实验中发现，造模后部分动物的昼夜眼压波动大于生理性昼夜波动，原因不明，需进一步研究阐明。③注射剂量很有讲究，若剂量太小(50 μL，2×105beads/injection)则眼压无变化，需要反复多次的注射;若剂量太大(500 μL，2×106beads/injection)一方面会造成眼压急剧升高或微球贴附于角膜内表面，造成角膜内皮失代偿;另一方面大量游离的微球永久性附着在晶状体前表面，对眼底观察、视觉电生理检测等造成困难。④由于微球会堵塞葡萄膜巩膜房水引流途径，若实验为了检测以该途径为靶点的抗青光眼药物效用而建模的话，可能不建议使用［11］。

该法诞生之初由于引起严重的前房炎症反应、游离微球漂浮等原因，被认为不宜推广;但如今随着材料和技术的不断改进，综合考虑其优缺点，前景广阔。至于目前国际上继Weber之后，未见他人采用该法建立猴慢性高眼压模型的相关报道，主要还是因为不愿在如此贵重的动物上尝试新方法，但不能因此而否定了它。如今，在乳胶微球的基础上，研究人员又新研制了带电荷微球、磁珠等［12］，通过吸附作用更加提高了造模的有效率和成功率;且我们已通过实验证实，前房注射磁珠不会对后续的功能磁共振检查造成影响。但国内外均未见有关应用于猴的报道，期待今后有进一步研究。

1.3 眼局部用激素 早在1964年就有人试图用此法诱导非人灵长类动物的高眼压模型，但没有成功。Gerometta等［13］曾报道使用0.1%的地塞米松乙醇溶液3次/d给猴子滴眼，经过4周，45%的猴子逐渐产生了高眼压(眼压平均升高10.6±3.6mm Hg)。而且激素诱导的高眼压有可逆性和可重复性，但若首次使用激素无效则续用仍然无法产生有效的高眼压。激素主要作用于小梁网区，通过小梁网激素受体介导肌动蛋白张力丝重组、可逆的肌动蛋白网络形成，并促进黏多糖、弹力蛋白、纤连蛋白生成，蛋白酶活性和细胞的吞噬功能下降，造成细小的纤维样细胞外基质在邻管区沉积增加，最终小梁网处无论是经细胞还是细胞旁的房水流出均减少。由于激素的副作用，该模型目前仅用于模拟临床激素性青光眼，不作为原发性青光眼的高眼压模型。

2 猴的其他青光眼模型

2.1 正常眼压性青光眼模型 近年来，越来越多的证据表明，正常眼压性青光眼(normal tension glaucoma，NTG)患者血清和房水中内皮素-1(ET-1)含量升高［14-16］，细胞内皮素受体B表达增加;且啮齿类动物实验证明ET-1通过内皮素受体B作用，阻断视神经轴突的轴浆运输，造成视神经损害［17-20］。另有研究［21］则在人体发现NTG患者静脉用选择性内皮素A受体拮抗剂后，视网膜血流有所改善。此外，有研究［22］表示ET不仅作用于眼后段，则使血管收缩、视网膜和视盘的血供减少，而且作用于眼前节，使小梁网收缩，在一定程度上扰乱了小梁网房水引流途径的自身调节功能。受此启发，Cioffi等［23］利用渗透压驱动原理，将ET-1通过迷你泵持续泵入猕猴视神经球后始发段的神经周围区域，诱导产生慢性视神经缺血模型，血流量减少可达36%，同时不影响IOP也不受IOP影响，可以作为NTG的模型。但也有研究者［24］使用同样方法并未观察到视盘有任何形态变化或者血流改变，可能与使用剂量、具体操作有关。作为一种新兴的建模方法，目前国际上尚未达成共识，其具体作用机制以及操作方法有待进一步研究。

2.2 急性眼压升高模型 长久以来一直采用前房灌注生理盐水，模仿一过性的房水生成增多，从而产生急性高眼压。由于房水引流途径未被破坏，停止灌注后经过一段时间，眼压会自行下降至初始水平。此法无更多创新，不赘述。

3 结语

青光眼建模成功的标准为组织病理学显示视盘杯状凹陷加深、筛板后凹、视网膜神经节细胞选择性丢失、神经纤维层变薄。高眼压不是青光眼的唯一致病因素，但却是一个确切的危险因素，因此建立高眼压模型，尤其是慢性高眼压模型成为研究青光眼疾病的关键。关于慢性高眼压模型，无论是激光光凝小梁网还是前房注入外来物，都围绕增加房水流出阻力来实现。相比之下，激光光凝法传统、可靠，乳胶微球法及其衍生出来的一些方法更加方便、有效，期望有更多研究人员采用。正常眼压性青光眼过去一直是造模的难点，现在ET法也带来希望;而急性高眼压模型则一贯通过前房灌注来实现。希望研究者按照自身实验要求，能在文中介绍的方法中找到适合自己的造模方法;也期待今后通过对以上方法的改进或者创新，会有更加符合理想标准的建模方法出现。

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