李新民， 秦潞平， 路岩莉

熄风胶囊对氯化锂－匹罗卡品癫痫大鼠反复自发性发作及海马损伤的干预作用

李新民， 秦潞平， 路岩莉

目的 观察中药熄风胶囊单药和联合用药干预治疗对氯化锂－匹罗卡品癫痫大鼠反复自发性发作及海马损伤的影响。方法 将SPF级健康雄性Wistar大鼠160只随机分为正常组、模型组、熄风胶囊高剂量干预组（熄高组）、熄风胶囊中剂量干预组（熄中组）、熄风胶囊低剂量干预组（熄低组）、熄风胶囊大剂量＋托吡酯联合干预组（联高组）、熄风胶囊大剂量＋托吡酯1／2剂量联合干预组（联低组）、托吡酯干预组（TPM组）各20只。运用氯化锂－匹罗卡品化学点燃法，复制癫痫大鼠模型，观察熄风胶囊单药和联合用药干预治疗对大鼠反复自发性发作（SRS）的影响；通过常规病理及电镜观察海马结构形态学改变，应用Timm组织化学染色法进行海马苔藓纤维出芽（MFS）的观察。结果 （1）所有干预组大鼠痫样发作平均级别均低于模型组而高于正常组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（2）各干预组诱发癫痫持续状态的大鼠SRS发作次数均高于正常组而低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.01），其中熄高组SRS次数低于熄中组、TPM组、熄低组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；联髙组SRS次数低于熄低组，差异有统计学意义（P＜0.01）。（3）Timm染色结果显示：所有干预组海马CA3始层及齿状回分子层Timm染色颗粒MFS总面积低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中在CA3区熄高组、联髙组、联低组与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。（4）光、电镜结果显示：各干预组中联低组海马结构损伤最轻，熄高组海马结构损伤较熄中组、熄低组轻。结论 熄风胶囊单药及与TPM联合用药可以有效地减低氯化锂－匹罗卡品癫痫大鼠的SRS，减轻海马损伤，抑制MFS。

癫痫／中医药疗法； 熄风胶囊／治疗应用； 大鼠； 动物，实验

熄风胶囊为马融教授根据“益肾填精，豁痰熄风”法则所研制。既往本课题组的实验研究表明，该药能下调戊四唑所致惊厥小鼠脑内c－fos的表达，降低神经元的兴奋性，并可通过促进小鼠脑内一氧化氮合酶的活性及表达，促进一氧化氮的释放，减轻戊四唑诱发惊厥后所出现的DNA、RNA改变，减少癫痫后所致脑损伤，发挥神经保护作用［1］。临床实践已证实熄风胶囊对小儿癫痫强直－阵挛性发作安全、有效［2］。本研究旨在利用氯化锂－匹罗卡品癫痫动物模型，观察熄风胶囊单药和联合用药治疗对该病造模大鼠反复自发性发作（spontaneous recurrent seizures，SRS）及海马损伤的干预作用，探讨中药、中西药联合治疗难治性癫痫的作用特点及作用机制，进一步为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性Wistar大鼠160只，体质量（200±10）g，购自解放军军事医学科学院实验动物中心（动物合格证号：SCXK－（军）2007－004），适应性喂养1周后开始实验。

1.2 实验药品 盐酸匹罗卡品、氯化锂（美国Sigma公司），托吡酯（西安杨森公司），研钵研碎成细粉末后配成药液浓度为2g／L；熄风胶囊（天津中医药大学第一附属医院杏林药厂），按高、中、低给药剂量用双蒸水配成，浓度分别为0.99、0.66、0.33g／mL。

1.3 实验器材 取材用开胸、取脑手术器械一套、恒温水浴箱江苏教学仪器厂、半自动切片机、超声机、冰冻切片机、光学显微镜、数码照相机、红外线摄像头4个、四路视频采集卡、OLYMPUS－BX40生物显微镜、HMIAS－2000高清晰度彩色病理图像分析系统、Leica超薄切片机、日立H－7500型透射电子显微镜。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 将160只大鼠按随机数字表法分成8组，即正常组、模型组、熄风胶囊高剂量干预组（熄高组）、熄风胶囊中剂量干预组（熄中组）、熄风胶囊低剂量干预组（熄低组）、熄风胶囊大剂量＋托吡酯联合干预组（联高组）、熄风胶囊大剂量＋托吡酯1／2剂量联合干预组（联低组）、托吡酯干预组（TPM组）。每组各20只大鼠。

1.4.2 模型制作 造模前，熄高组、熄中组、熄低组分别灌胃给予相应浓度的熄风胶囊药液2mL；联高组、联低组在灌胃给予高剂量熄风胶囊药液基础上，分别给予 TPM 20、10mg／kg；TPM 组灌胃给予TPM 20mg／kg；模型组和正常组：分别灌胃给予生理盐水2mL。每日1次，连续灌胃1周，第8天开始给予造模。并观察各组造模结果。除正常组20只，其余7组大鼠全部用于模型的复制。采用氯化锂按3mmol／kg（浓度1.5mol／L）剂量腹腔注射，18～20h后腹腔注射硫酸阿托品1mg／kg以减少外周胆碱能作用，30min后腹腔注射盐酸匹罗卡品按30mg／kg（浓度1%）注射，共注射1次，出现癫痫持续状态（status epilepticus，SE）的大鼠，待SE持续60～90min后，再给予地西泮10mg／kg腹腔注射解除抽搐，如不能缓解痫性发作，可重复注射地西泮1～2次，直到痫性发作被解除。均正常喂养，所有实验大鼠在4个红外摄像头下集中观察60d。

1.4.3 模型评价 惊厥评分采用Racine分级标准［3］。

1.5 观察指标

1.5.1 行为学评估 急性期观察各种大鼠异常行为及痫性发作程度；发作程度参照Racine分级标准。慢性期记录各组癫痫大鼠SRS次数。

1.5.2 Timm组织化学染色标本的制备 开颅取脑，置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）中24h。置于30%蔗糖溶液中，直至组织块沉底。冰冻切片机切片，片厚20μm。经过上述处理得到的厚冰冻切片晾干。暗室中将晾干切片浸入新鲜配制的孵育液中（10%阿拉伯胶60mL，柠檬酸缓冲液10mL，5.67%对苯二酚30mL，2%硝酸银2mL），恒温水浴箱孵育30～60min。移出孵育液后，在暗处将切片用蒸馏水洗5min，移出暗处后再用蒸馏水洗10min。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

每只实验动物选4张脑片，每组2只，在HMISA－2000高清晰度彩色医学图文分析系统分别测海马CA3及齿状回苔藓纤维出芽（MFS）的总面积。每组于400倍高倍镜下随机选取10个视域，用HMIAS－2000高清晰度彩色病理图像分析系统进行定量分析。以0.207μm像素点长，在1.825 6×104μm2测量窗下，测量棕黄色反应物信号的总面积、面积百分比的相对水平。

1.5.3 电镜标本的制备 以250mL含4%冷戊二醛的0.1mol／L PBS代替4%多聚甲醛0.1mol／L PBS进行内固定，直至肝脏、四肢、尾变硬。剥取海马后，将样品切成小于1mm×1mm×1mm的小块，放入4%戊二醛中前固定，用PBS充分清洗后，放入1%锇酸中后固定，再用PBS充分清洗，酒精梯度脱水，每次10～15min，再行100%丙酮脱水两次，每次10～15min，环氧树脂812、815混合物包埋、聚合后，用Leica超薄切片机切片，厚度为50nm，醋酸铀和柠檬酸铅双重电子染色，日立H－7500型透射电子显微镜观察、照相，加速电压80kV。

1.5.4 光镜标本的制备 10%水合氯醛0.3g／kg深度麻醉后，开胸暴露心脏，用改良后的50mL注射器针头从心尖处刺入左心室到达升主动脉，切开右心耳。生理盐水500mL加肝素钠12 500U快速滴注，直至肝脏变色，右心耳流出无色透明液体。再灌注4%冷多聚甲醛0.1mol／L PBS约250mL进行内固定直至肝脏、四肢、尾变硬。然后取含海马结构的2～3mm厚脑块（冠状切面），4%多聚甲醛液固定，石蜡包埋，常规光镜制片，片厚3μm，HE染色。光镜下观察海马结构形态学改变。

1.6 统计学方法 采用SPSS 12.0软件对实验数据进行统计学处理。计量资料采用±s表示，多组比较用单因素方差分析（one－way ANOVA），不同组别两两比较用q检验；计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实验大鼠痫性发作情况

2.1.1 急性期 模型组平均发作级别为Ⅳ级；熄中组、熄低组和TPM组发作级别为Ⅲ级；熄高组、联髙组和联低组发作级别为Ⅱ级，见表1。

表1 造模后大鼠癫痫发作程度分析（±s，n＝20）

表1 造模后大鼠癫痫发作程度分析（±s，n＝20）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05；与熄高组比较，cP＜0.05；与联髙组比较，dP＜0.05。

组别 发作级别正常组0模型组 4.20±1.28ac熄高组 2.60±1.64ab熄中组 3.20±1.20abd熄低组 3.45±1.10abcd联髙组 2.40±1.43ab联低组 2.45±1.47ab TPM 组 3.30±0.87abd

表1可见，所有药物干预组大鼠造模后发作级别均低于模型对照组高于正常组（P＜0.05）；其中熄高组发作级别低于熄低组，联髙组发作级别明显低于熄中组、熄低组（P＜0.05）。

2.1.2 静止期 模型组4只大鼠分别于造模后第3、4、6天相继死亡，各干预组SE大鼠未见死亡。各组发作未达SE的大鼠活动正常。此期持续2～15d，各组持续时间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.1.3 慢性期 各造模组于急性期诱发癫痫持续状态的所有大鼠，在慢性期均出现SRS，见表2。

表2 熄风胶囊干预治疗对造模大鼠SRS的影响（±s）

表2 熄风胶囊干预治疗对造模大鼠SRS的影响（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05；与熄高组比较，cP＜0.05；与联髙组比较，dP＜0.05。

组别 n SRS 20 0模型组 13 22.31±2.69a熄高组 7 5.57±1.51ab熄中组 9 7.78±1.56abc熄低组 14 13.64±2.90abd联髙组 5 5.20±1.30ab联低组 7 5.14±1.95ab TPM 组 8 7.88±1.13正常组abc次数

表2可见，模型组SE大鼠SRS次数最多，各干预组SE大鼠SRS发作次数均高于正常组而低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01），其中熄高组明显低于熄中组、TPM组、熄低组，差异有统计学意义（P＜0.05），联髙组显著低于熄低组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 熄风胶囊干预治疗对造模大鼠海马苔藓纤维出芽（mossy fiber sprouting，MFS）的影响 见表3。各干预组及模型组出现癫痫持续状态的癫痫大鼠海马CA3始层及齿状回分子层皆可见染色颗粒明显增多，呈点片状及带状分布，见图1（封三）。

表3 熄风胶囊干预治疗对造模大鼠MFS的影响（±s，n＝5）

表3 熄风胶囊干预治疗对造模大鼠MFS的影响（±s，n＝5）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05；与熄高组比较，cP＜0.05；与联合治疗组比较，dP＜0.05。

组别MFS的总面积CA3区118.17±86.62 33.33±49.36模型组 1 441.25±540.01abc 829.60±344.22ab熄高组 312.59±121.52b 303.08±119.68ab熄中组 520.22±127.84abcd 361.14±137.66ab熄低组 564.66±325.59abcd 400.45±198.44ab联高组 320.86±93.92b 240.14±116.16ab联低组 262.56±81.11b 288.95±144.13ab TPM 组 573.27±299.75abcd 342.32±100.42齿状回正常组ab

表3可见，所有干预组海马CA3始层及齿状回分子层Timm染色颗粒MFS总面积低于模型组（P＜0.05）。在海马CA3区，熄高组的作用优于中剂量、低剂量和TPM组（P＜0.05），联合治疗组的作用优于熄中组、熄低组和TPM组（P＜0.05）。熄高组、联髙组、联低组在CA3区、齿状回分子层，3者差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 熄风胶囊干预治疗对造模大鼠海马结构形态学的影响 光镜结果见图2（封三），其中正常组CA1，CA3可见正常的神经元，齿状回门区可见颗粒细胞排列整齐。模型组CA1区和CA3区及齿状回可见许多神经元发生变性、坏死。变性的神经元肿胀，体积增大，核固缩。坏死的神经元胞质浓缩、深染，核碎裂。熄高组CA1区细胞变性不明显，CA3区偶见细胞核固缩，变性，大多数细胞核清晰。齿状回颗粒细胞排列整齐，偶见细胞核固缩、变性。熄中组CA1区可见核固缩散在，CA3区大多细胞核清晰，齿状回可见核固缩，细胞排列欠整齐。熄低组CA1区可见细胞萎缩，偶可见神经元发生变性和固缩核，CA3区可见较多固缩核，细胞排列不整齐，齿状回区可见神经元核固缩、坏死。联高组CA1区和CA3区及齿状回细胞形态较好，偶见神经元变性、核固缩。联低组CA1区和CA3区及齿状回细胞形态较好，较少见神经元变性、核固缩。TPM组CA1区细胞层数2～3层，可见变性细胞核，CA3区细胞减少，齿状回可见核固缩、变性，细胞周围水肿。

2.4 熄风胶囊干预治疗对造模大鼠海马超微结构损伤的影响 电镜结果显示：正常组神经细胞结构基本正常。模型组组织明显损伤。熄高组细胞质和核质轻度水肿，细胞器胞质内可见大量内质网呈轻度扩张。熄中组细胞质和核质轻中度水肿，细胞器的数量减少，胞质内空化。熄低组细胞质和核质中度水肿，细胞器的数量明显减少，胞质空泡化。联高组接近正常神经元。联低组接近正常神经元。TPM组细胞质和核质中度水肿，见图3（封三）。

3 讨论

马融教授根据“益肾填精，豁痰熄风”法则，研制出熄风胶囊，方中紫河车味甘、咸、温，为君药，益肾填精，补脑益智，以达治痫之本；天麻平肝潜阳、熄风止痉，其辛润不燥，为风中之润剂，治风之妙药，且其尚具祛痰之功，兼具熄风豁痰之长，为治痫之要药；更配以石菖蒲之辛香避秽、豁痰开窍以达治痫之标，共为臣药。方中借全蝎、僵蚕熄风止痉，白金丸行气豁痰，共为佐使药，以助豁痰熄风之力。因痰有聚散，风有动静，导致痫证作止无常，用虫类药旨在取其性善走窜，可以入脏腑、经络以搜风剔痰，即所谓“以动制动”。诸药合用，共奏益肾填精、豁痰熄风之功，以达标本兼顾，扶正祛邪之目的。

既往实验研究表明，熄风胶囊能下调戊四唑所致惊厥小鼠脑内c－fos的表达，减轻神经元的兴奋性，并能够通过促进小鼠脑内一氧化氮合酶的活性及表达促进一氧化氮的释放，减轻戊四唑诱发惊厥后所出现的DNA、RNA改变，减轻癫痫后所致脑损伤，发挥神经保护作用［1］。临床实践已经证明熄风胶囊对小儿癫痫强直－阵挛性发作安全、有效［2］。

MFS及突触结构损伤是颞叶癫痫形成的主要病理基础，为癫痫长期反复发作的原因［4，5］。MFS与癫痫的SRS密切相关［6，7］。在痫性损伤后，苔藓纤维生侧支进入颗粒体层、齿状回内分子层以及CA3区起始层，重建海马神经网络，形成的兴奋性突触占优势，同时齿状回对兴奋的滤过作用降低，冲动便在再生神经回路中迅速传播，最终导致癫痫反复发作。

本实验中各干预组及模型组出现SE的癫痫大鼠海马CA3始层及齿状回分子层皆可见染色颗粒明显增多，呈点片状及带状分布。所有干预治疗组海马CA3始层及齿状回分子层Timm染色颗粒MFS总面积低于模型组，其中在CA3区熄高组、联髙组、联低组与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。熄高组、联髙组、联低组无论是在CA3区还是在齿状回分子层，3者作用差异无统计学意义。

本研究表明，熄风胶囊单药及与TPM联合用药可以有效地减低氯化锂－匹罗卡品癫痫大鼠的SRS，而且在联合用药的同时能适当减少西药的剂量。熄风胶囊控制SRS的作用机制可能与保护神经元细胞，减轻海马损伤，抑制MFS有关。为临床应用中药治疗癫痫提供了理论依据。

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［2］ 马融，李新民，魏小维，等.熄风胶囊治疗小儿癫痫强直－阵挛性发作的研究［J］.天津中医药，2003，20（2）：87.

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The Intervention of Xifeng capsule on spontaneous recurrent seizures and hippocampalformation lesion in epileptic rats induced by Lithium－Pilocarpine

LIXin－min，QINLu－ping，LUYan－li.FirstAffiliatedHospitalofTianjinUniversityofTraditional

ChineseMedicine，Tianjin300193，China

Objective To study the intervention of Xifeng capsule single and combination effect on spontaneous recurrent seizures（SRS）and hippocampal formation lesion in epileptic rats induced by Lithium－Pilocarpine.Methods All experimental rats were randomly divided into eight groups：normal control group，model group，Xifeng high－dose group，Xifeng middle－dose group，Xifeng low－dose group，Xifeng high－dose＋ TPM group，Xifeng high－dose＋ TPM 1／2dose group，TPM group.We use lithium－pilocarpine chemical ignition method to duplicate the epileptic rat model.And with conventional histopathological method and transmission electron microscope were utilized to observe morphological changes in hippocampal formation，Timm histochemical technique was adopted to study mossy fiber sprouting.Results （1）To compare the situation from the seizures in rats，the average attack level of all rats of Intervention group lower than model group（P＜0.05），but higher than the control group（P＜0.01）.（2）All intervention group，the SRS frequencies obviously lower than model group（P＜0.05）.（3）In all intervention group，the total aera of mossy fiber sprouting（MFS）of the hippocampal CA3subfield and dentate gyrus were more than that of normal group（P＜0.05）.Both in the hippocampal CA3subfield and dentate gyrus，the total aera of mossy fiber sprouting（MFS）have significance difference between Xifeng high－dose group and Xifeng low－dose group（P＜0.05）.（4）Using conventional histopathological method and transmission electron microscope，ultrastructure of neurons in hip－pocampus was regular in normal group but damaged obviously in model group.In all therapy groups.The damage of neuron in hippocampus was ameliorated in Xifeng high－dose＋ TPM1／2dose group，in Xifeng high－dose group.The damage of neuron in hippocampus was less than in Xifeng middle－dose group and in Xifeng low－dose group.Conclusion The intervention of Xifeng capsule single and combination can effectively reduce the degree of epileptic seizures in rats，protect hippocampal neurons from being more seriously and deterred hippocampal mossy fiber sprouting（MFS）.

Epilepsy／Chinese medicine therapy； Xifeng capsule； Rat； Experiment，animal

天津市高等学校科技发展基金重点项目（2009ZD03）

300193天津，天津中医药大学第一附属医院儿科

李新民（1964－），男，主任医师，博士研究生导师。研究方向：小儿脑系疾病的诊断与治疗。

路岩莉，300193天津，天津中医药大学第一附属医院儿科。

10.3969／j.issn.1674－3865.2012.06.001

R－33

A

1674－3865（2012）06－0481－04

2012－09－05）

黄伟）

临床研究