肖阳，李庆章，张莉

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

奶牛不同发育时期乳腺细胞凋亡规律的研究

肖阳，李庆章，张莉

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

为系统地研究奶牛乳腺不同发育时期细胞凋亡的规律，应用TUNEL法对奶牛不同发育时期正常乳腺组织（冰冻切片）的乳腺细胞凋亡进行了系统检测。结果表明，青春期乳腺发育缓慢，结构变化较小，乳腺细胞凋亡量相对较少；妊娠期乳腺导管持续发育，凋亡量上升，其中妊娠初期2月，乳腺腺泡大量出现，脂肪细胞凋亡随之增加，出现了一个高峰；泌乳期乳腺的结构和功能最为完善，乳腺结构变化很小，细胞凋亡量维持在很低水平；退化期腺泡瓦解，大量细胞发生凋亡，其中退化初期乳腺细胞凋亡持续增加，退化3 d达到最大值，之后凋亡量逐渐降低，退化30 d后乳腺已经基本恢复到青春期状态，凋亡细胞量也随之减少。

奶牛；乳腺；冰冻切片；细胞凋亡；TUENL

0 引 言

细胞凋亡是1972年由英国阿伯丁大学病理学教授Kerr等[1]首先提出的。乳腺上皮细胞凋亡主要出现在退化期[2-3]，是乳腺的一种自我修复机制[4]。退化的机制包括局部乳成分的化学反馈、储存乳成分的形成、产奶停滞和乳房膨胀，以及细胞伸张导致乳分泌活力的损耗[5,6]。在组织水平，乳腺退化过程涉及白细胞吞噬、持续的上皮细胞死亡，或结缔组织的增殖[7-9]。乳腺上皮细胞的凋亡对乳腺的发育和功能有重要作用[10]，是乳腺实现其功能的必经阶段。因此，系统地研究乳腺发育过程中乳腺上皮细胞凋亡的周期性规律，可以更好地了解乳腺发育结构变化与泌乳功能的关系，有利于找到可以适当延长泌乳期、提高产奶量的生物调控方法。

1 实 验

1.1 动物及取材

本研究选用36头经检测无乳腺炎及其他疾病的健康荷斯坦奶牛作为实验动物。

奶牛饲养到预订取样时间，乳房中部消毒，按常规手术切取少量乳腺组织块，获取组织样本，20 min内液氮冻存，实验室-80℃冰箱保存备用。

采样12个时间点：青春期（12月、14月），妊娠期（2月、4月、6月），围产前期（分娩前7日），泌乳期（7日、50日、140日、280日），干乳期（3日、30日）。 每个采样时间点选取3头奶牛做平行实验。每次试验至少重复3次。

1.2 试剂

DeadEndTMFluorometric TUNEL System（Pro-mega No.G3250），DNaseⅠ （TaKaRa No.D2210），DAPI（Sigma），其他试剂为国产分析纯试剂。

1.3 方法

1.3.1 冰冻切片

冰冻切片机使用前将温度调至-25℃预冷30 min，从液氮中取出待切片乳腺组织，自然解冻后用包埋剂将其固定在托架上，置于速冷台上冷冻。待乳腺组织冷冻好以后，调整刀片和组织块之间的位置，连续切片。将切片贴于包被好的载玻片上，每张切片厚度8 μm。

1.3.2 TUNEL检测

切片置4%多聚甲醛20 min，PBS缓冲液 （pH值为7.4）洗2次，每次5 min。TdT酶处理切片10 min，TUNEL反应混合液37℃孵育切片60 min（潮湿环境），切片置于2×SSC终止液中室温终止15 min，PBS缓冲液（pH值为7.4）漂洗切片3次，每次5 min。切片进行细胞核复染，DAPI染色10 min，去离子水洗涤切片3次，每次5 min。抗荧光淬灭封片剂封片，置于荧光显微镜下观察，在同一视野分别拍摄荧光素标记的绿色阳性信号和DAPI标记的蓝色核。

阳性对照采用了DNaseⅠ强制使组织切片中DNA断裂，阴性对照移除TdT酶，用去离子水代替。

1.3.3 数据处理与统计分析

使用软件Image Pro Plus 5.0制作合成图片，乳腺细胞凋亡的荧光强度用Image Pro 5.0 Plus软件进行分析，平均光密度值=光密度值/面积。所得数据均用平均数±标准差表示，多组数据之间应用SPSS（SPSS.16.0）统计分析软件进行方差分析。

2 结 果

2.1 组织切片TUNEL结果

不同发育时期奶牛乳腺进行冰冻切片，每个时期取3头牛的乳腺进行切片，每块组织取连续3张切片，1张用于TUNEL法检测阴性对照，1张用于TUNEL法检测阳性对照，1张作正常TUNEL法检测，荧光显微镜观察，放大200倍（标尺为100um）。图片由Image-pro plus 5.0软件合成。各时期结果如图1所示，阳性结果如图2所示。

蓝色荧光代表DAPI染色细胞核，绿色荧光代表荧光素标记的绿色信号

由图1可以看出，青春期12个月，开始形成腺泡芽，导管系统迅速增长膨胀。一些大导管已经有了导管腔，乳腺主要由脂肪组织组成。由图A-a可以看出青春期12个月基本检测不到细胞凋亡的阳性信号。青春期14个月，可以看出导管系统不断发育，分支增多。图片上可以看到较多的有导管腔的大导管。管腔增大，占据脂肪细胞位置。由图A-b可以看出青春期14个月基本检测不到细胞凋亡的阳性信号。

妊娠期2个月，乳腺导管系统和腺泡迅速生长发育，导管分支大量增殖。腺泡芽大量形成，上皮细胞快速增殖和分化，小叶内和小叶间的脂肪组织均明显减少。奶牛乳腺中的脂肪组织逐渐被导管等实体组织所代替，实体组织已经成为乳腺的主要组成部分。如图B-a白色箭头可见，妊娠初期2个月，绿色荧光信号很多，表明凋亡细胞的数量很多。妊娠4个月，奶牛乳腺组织中导管系统占据了大部分的乳腺位置，同时有少量腺泡结构出现。乳腺上皮细胞继续以较快的速度增长，细胞体积进一步增大，腺泡腔逐步扩大。牛妊娠4～5个月时，小叶已经很明显，终末乳导管开始出现，腺泡腔未完全形成。由图B-b可以看出，妊娠4个月乳腺组织中有一定量的荧光信号，主要在乳腺脂肪垫中，少量存在于腺泡上皮细胞中。妊娠6个月乳腺已经完全发育，腺泡腔大量出现，腺泡和导管的体积不断增大。大量的小叶腺泡发育完全，腺泡分泌活动进一步增强，腺泡腔内含有大量分泌物，腺泡也因此而扩张。由图B-c可以看出妊娠期6个月基本检测不到细胞凋亡的阳性信号。奶牛乳腺妊娠7～9个月时，即产前时期，腺泡进一步增大，腺上皮细胞开始具备分泌功能。同时，在组织结构上接近于泌乳的乳房。约在分娩前2日，腺泡分泌初乳。由图B-d可以看出，围产期乳腺组织中出现一定量的荧光信号，主要在乳腺脂肪垫中，少量存在于腺泡上皮细胞中。

泌乳期乳腺中几乎没有脂肪细胞。随着乳汁的产生和泌乳的开始，泌乳7 d和50 d，乳腺的腺泡开始增大、增多。由图C-a和图C-b可以看出，泌乳7 d和50 d乳腺组织中基本看不到凋亡信号。泌乳140 d，乳腺的结构和功能都更加完善，是乳腺功能的高峰时期。由图C-c可以看出，泌乳140 d乳腺组织中基本看不到凋亡信号。泌乳280 d，乳腺的结构和功能发生改变，有少量腺泡结构破损，泌乳功能降低。由C-d图可以看出，泌乳280 d乳腺组织中可以检测到极少量的凋亡信号，主要分布在乳腺腺泡上皮细胞。

退化3 d，随着泌乳的结束，乳腺进入退化过程，腺泡结构继续解体，导管和腺泡上皮细胞开始发生凋亡。由图D-a可以看出，退化3 d导管和腺泡中开始出现较多的凋亡荧光信号。大部分乳腺细胞进入凋亡过程。主要分布在导管和破损的乳腺腺泡上皮细胞中。退化30 d，乳腺继续退化，导管和腺泡继续萎缩，实体组织之间出现脂肪细胞，大量的脂肪细胞围绕在实体组织周围，乳腺基本恢复至青春晚期的形态。由图D-b可以看出，退化30 d乳腺中已经基本看不到凋亡信号。

阳性对照，从图中可以看出，由于先用DNaseⅠ人工切断组织DNA，使得所有细胞基本都标记了很强的绿色荧光。

2.2 乳腺细胞凋亡变化统计

每张切片进行荧光显微镜观察时随机取5个视野拍摄荧光图片，所得结果用Image Pro 5.0 Plus软件进行荧光强度分析，各时期奶牛乳腺组织的凋亡程度用各时期的平均荧光强度±标准差表示（表1），统计结果用SPSS16.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05表示具有显著性差异。

表1 奶牛乳腺细胞凋亡TUNEL法检测结果

根据所得的数据结果，各个时期奶牛乳腺细胞凋亡的变化趋势如图3所示。

从图3可以看出，青春期乳腺发育缓慢，乳腺细胞凋亡不明显。妊娠初期，乳腺细胞以指数速率增殖，出现大量导管分支和导管腔，细胞损耗增多，因此细胞凋亡明显上升。进入泌乳期，乳腺结构一直稳定，维持功能性腺泡状态，因此整个泌乳期，细胞凋亡不明显。进入退化期，乳腺上皮细胞凋亡数目显著增加，在退化3 d达到高峰，随后下降，在退化30 d，乳腺结构基本恢复到妊娠初期水平，乳腺组织中也基本检测不到凋亡细胞的存在。

3 讨 论

奶牛乳腺组织发育各阶段结构和功能都有特定的变化，与此相适应的细胞凋亡检测结果呈现规律性变化。Holst等人报道过奶牛乳腺组织退化期的组织学和超微结构。指出腺泡上皮细胞是泌乳期很明显的特征，退化期2天，腺泡上皮细胞含有大的液泡，此现象持续到第3周都能观察到，但是此时高尔基体不明显，粗面内质网和线粒体在整个研究时期都能观察到。退化期过程中，小泡间空间递增，同时腺泡腔空间减少。超微结构检测表明在退化期21 d和30 d的腺泡上皮细胞呈现出功能性活跃但是泌乳量不活跃的现象[11]。在本研究中，虽然不是从超微结构来探讨奶牛乳腺组织中的细胞器变化，但是在组织学水平上得到了类似的结果。

刚进入青春期的动物，乳腺发育平稳，乳腺组织大部分为脂肪垫结构，处于等速生长（isometric growth）。实质几乎不发育，导管很小不发达，，此阶段的TUNEL法检测结果也显示出非常少的阳性信号。随着体内激素水平的增高，导管系统开始生长，侵入脂肪垫，此时开始异速生长（allometric growth）[12]。妊娠期乳腺发育迅速，导管系统和腺泡迅速生长发育，在雌激素和孕酮的协同作用下，乳腺导管开始分支，脂肪垫上分布着许多大小不一、形态各异的腺泡，乳腺细胞逐渐以指数速率增殖[13]。妊娠2个月时，在垂体、卵巢和胎盘分泌的多种激素的共同作用下，导管系统和腺泡迅速生长发育，上皮细胞快速增殖和分化，导致细胞损耗很多，因此，TUNEL法检测阳性信号很多。围产期，腺泡分泌活动进一步增强，细胞损耗增多，腺泡腔也因此扩张很大，因此TUNEL法检测阳性信号也有了一个小高峰。泌乳期腺泡的结构与妊娠后期基本相同，但乳腺发育并未终止[14]。乳腺实质和乳腺上皮细胞一直持续增殖，泌乳期乳腺小叶内充满大的腺泡，乳房明显增大，直到泌乳起始乳腺才成为分化和发育完全的成体器官，所以泌乳期乳腺细胞的数目是决定乳产量的至关重要的因素[15]。这一时期，乳腺结构稳定，几乎没有新生和退化的结构变化，因此凋亡信号不明显。泌乳晚期直至退化之前，乳腺腺泡结构开始打开，逐渐向退化期过渡，腺泡上皮细胞逐渐开始发生凋亡，此时凋亡信号要比泌乳初期的多。乳腺退化期是动物哺乳周期一个重要的乳腺修复过程。在本研究中，TUNEL法检测结果表明，退化3 d时乳腺上皮细胞凋亡数量达到峰值，绿色阳性信号几乎满屏，随后下降，恢复到青春期状态，开始下一轮往复循环。

综上所述，在整个乳腺发育、泌乳和退化的过程中，伴随着乳腺结构的变化，乳腺组织共经历3个比较明显的凋亡过程。第一个凋亡高峰在妊娠期2个月，导管腔增大，乳腺组织中脂肪细胞和导管周围的结缔组织细胞凋亡显著。围产期产前7天，这一阶段导管分支增多伴随着乳腺脂肪垫的脂肪细胞消失，乳腺组织中凋亡信号达到第二个小高峰。进入泌乳期，乳腺结构一直稳定维持功能性腺泡状态，细胞凋亡不明显，直到泌乳晚期至退化期，乳腺退化启动，从泌乳280 d开始，乳腺上皮细胞凋亡数目开始增加，到退化3 d达到高峰，这是乳腺组织在发育循环中的第三个细胞凋亡高峰。随后下降，在退化30 d基本恢复到青春初期水平，至此乳腺组织完成泌乳后的重建，结构也恢复到青春期性成熟时的状态。

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Study on apoptosis of bovine mammary gland in different development stages

XIAO Yang,LI Qing-zhang,ZHANG Li
（Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

The purpose is to explore the regulation of apoptosis at different developmental stages in dairy cow mammary gland.Normal cow mammary gland tissues of different developmental stages were sliced in frozen.TUNEL was used to detect the apoptosis of mammary cell.The results showed that the virgin mammary gland developed slowly,little changes in mammary gland,and at this time,no apoptosis was detected.In pregnancy,mammary gland ductal continued to grow,and apoptosis increased.In initial pregnancy 2m,there were a lot of gland alveolus and simultaneously adipocyte apoptosis began to increase,and appearing a secondary apoptosis peak.In lactation,the structure and function of mammary gland were most complete,no changes in mammary gland structure and apoptosis level was low.In involution,gland alveolus collapsed and a lot of cells were apoptosis.In involution 3d,the apoptosis was highest and then decreased.In involution 30d,the mammary gland was recovered and apoptosis decreased.

dairy cow;mammary gland;frozen section;apoptosis;TUNEL

TS252.1

A

1001-2230（2012）09-0019-04

2011-11-11

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2006AA10Z1A4）；黑龙江省博士后基金（LBH-Z09270）；东北农业大学创新团队项目（LXT005-1-1/-2）；东北农业大学博士科研启动基金（190106）资助。

肖阳（1985-），女，硕士研究生，研究方向为乳腺发育与泌乳功能调控。

李庆章