迟菲菲，田丰伟，王刚，刘小鸣，张秋香，张灏，陈卫

（江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

植物乳杆菌LP1001缓解小鼠酒精性肝损伤的研究

迟菲菲，田丰伟，王刚，刘小鸣，张秋香，张灏，陈卫

（江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

植物乳杆菌LP1001是一株从泡菜中分离得到的具有良好抗氧化功能的乳酸菌，通过动物实验探讨 其对急性和慢性酒精性肝损伤的干预作用。将40只小鼠分成空白组、模型组、低、中、高剂量组5组，比较两种肝损伤模型中各组小鼠的肝指数，测定血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）和肝匀浆中谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、甘油三酯（TG）的浓度，并观察肝脏的病理学变化。结果表明，不同剂量的LP1001可在不同程度上抑制酒精引起的ALT、AST、TG和MDA浓度的升高以及GSH的降低，其中高剂量组的作用尤其显著，可使各指标基本恢复到正常水平；并且LP1001对慢性酒精性肝损伤的缓解更为明显，与病理学观察结果相互印证。综上，植物乳杆菌LP1001对小鼠的急慢性酒精性肝损伤均能起到一定的保护作用。

乳酸菌；酒精性肝损伤；小鼠；氧化应激

0 引 言

酒精性肝损伤主要包括：酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化和肝癌，在我国酒精所致的肝损伤逐年上升[1-3]。已有报道酒精在肝脏中代谢异常时会产生过量的自由基，引起氧化应激，导致肝损伤[4-6]。因此，探寻抑制氧化应激、预防和治疗酒精性肝病的措施具有重要意义。

乳酸菌具有调节肠道菌群，提高免疫力，抗氧化，降胆固醇等多种功能[7-10]，某些乳酸菌还可以通过减轻氧化应激、改善肠道通透性和调节肠道菌群从而缓解酒精引起的肝功能的下降[11-13]。

植物乳杆菌LP1001为本实验室以对过氧化氢的耐受能力为指标，从泡菜中筛选得到的一株具有较高抗氧化活性的乳酸菌[14]。本实验进一步通过小鼠的急性和慢性酒精性肝损伤模型，对其护肝效果进行研究。

1 实 验

1.1 材料

实验动物：SPF级健康昆明小鼠，雄性，18～20 g；许可证号码：SCXK（沪）2007-0005。饲养于12 h光照/12 h黑暗、相对湿度40%～60%，室温（23±2）℃的标准化动物房内，自由采食和饮水，动物适应性饲养1周后进行实验。

实验试剂为MRS培养基；脱脂乳粉。

1.2 主要仪器

SW-CJ-1CV超净台，恒温培养箱，Eppendorf 5804R冷冻离心机，UV2100紫外可见分光光度计，J6大容量冷冻离心机。

1.3 方法

1.3.1 LP1001的制备

将冻存于-80℃的植物乳杆菌LP1001复苏、活化两代，在MRS液体培养基中培养18 h后，6 000 r/min离心10 min，弃上清，用无菌的PBS缓冲液清洗两遍，质量分数为12%脱脂乳作为保护剂，冻干浓缩。灌胃小鼠时，用质量分数为0.9%生理盐水重悬，调整菌液至所需浓度，在37℃水浴中复苏30 min后使用。

1.3.2 急性酒精性肝损伤动物实验

将40只小鼠随机分成5组，每组8只，空白组和模型组灌胃脱脂乳，乳酸菌低、中、高剂量组分别灌胃浓度为107，108和109mL-1的植物乳杆菌LP1001菌悬液。连续30 d，末次灌胃1 h后空白组灌胃脱脂乳，其余各组灌胃体积分数为50%的乙醇，所有样品均按照10 mL/kg体质量进行灌胃，每天一次。

1.3.3 慢性酒精性肝损伤动物实验

将40只小鼠随机分成5组，每组8只，所有样品均按照10 mL/kg体质量进行灌胃，每天灌胃两次。上午空白组灌胃脱脂乳，其余各组灌胃乙醇溶液（乙醇体积分数按照20%，25%，30%，35%，40%逐渐增加， 在两周内增至40%后维持此浓度至实验结束）；下午空白组和模型组灌胃脱脂乳，乳酸菌低、中、高剂量组分别灌胃浓度为107，108和109mL-1的植物乳杆菌LP1001菌悬液。两次灌胃间隔8 h，实验时间为90 d。

1.3.4 样品处理

末次灌胃后禁食12 h，摘眼球取血，所得血清用于ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）、TG（甘油三酯）的测定。颈椎脱臼处死后，迅速解剖小鼠并取出肝脏，将左叶同一部位的肝脏用苏木精和伊红（HE）染色，以进行病理学检查。剩余部分制备成10%的肝匀浆液，用于GSH（谷胱甘肽）、MDA（丙二醛）、TG（甘油三酯）的测定。ALT、AST、TG、GSH、MDA各 项 指标的测定均按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计方法

所有数据均用统计软件SPSS16.0进行统计学处理，各项指标结果以“平均值±标准差”表示，以One-way ANOVA进行显著性检验。

2 结 果

2.1 LP1001对小鼠体质量、肝质量及肝指数的影响

肝指数是肝质量与体质量的比值，它在一定程度上反映了肝脏的健康与否，当发生病变时往往会引起器官的萎缩或肿胀从而导致肝指数也随之发生变化。表1为LP1001对小鼠体质量、肝质量和肝指数的影响。由表1可以看出，急性肝损伤的各组小鼠在体质量、肝质量与肝指数上基本没有差异；慢性肝损伤实验中，各组小鼠体质量较近似，但模型组小鼠的肝质量与肝指数较空白组显著增加，说明酒精的摄入会引起肝脏肿胀、变大，而灌胃中、高剂量的LP1001可以使其降低至正常水平。

表1 LP1001对小鼠体质量、肝质量及肝指数的影响

2.2 LP1001对小鼠血清指标的影响

ALT和AST是反映肝损伤的常用酶学指标，主要存在于肝细胞的胞浆内，AST还分布在线粒体中，当肝脏受损时，细胞内的转氨酶可进入血液，引起血清中ALT和AST水平升高。TG的浓度则反映了肝细胞内脂肪变性的情况，TG含量越高表明肝细胞中由于氧化应激和脂质代谢紊乱引起的脂肪变性越严重。在急性肝损伤实验中，与空白组相比，模型组血清的ALT与AST活力明显升高（P＜0.05），灌胃LP1001组可使酶活力降低，尤其是高剂量组的ALT活力已接近正常水平，各组TG的浓度没有差异；在慢性肝损伤实验中，模型组的ALT、AST和TG浓度与空白组相比均升高且差异显著 （P＜0.05），而LP1001的摄入可使其有所下降，尤其是中、高剂量组的LP1001可显著降低各项指标的水平（P＜0.05），并与空白组无差异（见表2）。说明造模基本成功，且灌胃LP1001能够使ALT、AST和TG得到改善。

表2 LP1001对小鼠血清ALT、AST和TG的影响

2.3 LP1001对小鼠肝匀浆指标的影响

自由基及其诱导的脂质过氧化是造成肝组织损伤的重要原因之一，MDA为脂质过氧化的副产物，其量大小可反映机体内脂质过氧化水平，间接反映出肝细胞受损伤的程度；GSH为体内重要的抗氧化物，直接参与酒精代谢过程中自由基的清除，减轻和阻止活性氧的过氧化作用[15-16]，因此TG的浓度反映了肝细胞脂肪变性的情况，而GSH和MDA则可以表征肝脏氧化损伤的程度，实验结果如表3所示。由表3可以看出，在急性肝损伤实验中，与空白组相比，模型组肝匀浆的TG和MDA浓度显著升高，而GSH质量分数下降（P＜0.05），灌胃LP1001后各项指标均得到改善，其中，中、高剂量的LP1001使TG水平下降（P＜0.05），高剂量组GSH质量分数明显高于模型组、MDA浓度基本上降低至正常水平（P＞0.05）；在慢性肝损伤实验中，与空白组相比，模型组肝匀浆的TG和MDA浓度显著升高，而GSH质量分数下降（P＜0.05），LP1001的摄入（尤其是高剂量组）可以显著降低TG和MDA的浓度，同时大大增加GSH的质量分数（与模型组相比，P＜0.05）。从而进一步证明造模成功，且高剂量的LP1001可以使酒精性肝损伤基本恢复到正常水平。

表3 LP1001对小鼠肝脏TG、GSH和MDA的影响

2.4 LP1001对小鼠肝脏病理学改变的影响

2.4.1 急性酒精性肝损伤实验的病理学观察

对肝组织切片进行HE染色，结果如图1所示。由图1可以看出，空白组肝小叶清晰完整，肝索排列整齐，肝细胞具有正常的形态与结构，无脂肪变性与炎性浸润；模型组肝索排列杂乱，肝细胞肿胀变形，胞浆疏松，细胞核固缩，出现炎性细胞浸润；低剂量组与模型组类似，有较多炎性细胞；中剂量组比低剂量组略有改善，存在少数核固缩和炎性细胞；高剂量组的效果明显优于低、中剂量，肝小叶形态基本正常，核固缩和炎性细胞显著减少。

2.4.2 慢性酒精性肝损伤实验的病理学观察

对肝组织切片进行HE染色，结果如图2所示。由图2可以看出，空白组肝细胞索结构完整，呈放射状，肝小叶结构清晰，肝细胞有明显的界线且胞浆均匀，无脂肪空洞和炎性浸润；模型组脂肪变性明显，有大片的脂肪空洞，肝细胞肿胀变形、胞质浑浊，有网状结构，少数核固缩，出现炎性细胞浸润；低剂量组脂肪空洞较多，肝细胞肿胀，有网状结构和轻度炎性浸润；中剂量组与模型组和低剂量组相比脂肪空洞略有减少；高剂量组肝脏脂肪变性明显减轻，几乎无脂肪空洞，基本正常。

3 讨 论

迄今为止，有关酒精性肝损伤确切的发病机制尚不清楚。一般认为，长期、大剂量酒精摄入时，肝细胞的脂质过氧化反应增强，产生大量的自由基，引起肝组织的氧化损伤[15]，同时免疫因素及乙醇代谢产物的毒害作用也是可能的致病原因。因此，目前用于防治酒精性肝损伤的多为一些具有抗氧化、清除自由基功能的中药、天然提取物，如：铁皮石斛、玉米肽、蛇床子素、轮叶党参提取物、白藜芦醇等[17-21]。

近年来随着对乳酸菌的深入研究，利用乳酸菌改善酒精性肝病越来越受到关注[11-12,22]。本研究选用的植物乳杆菌LP1001为前期筛选的、已证明具有较好抗氧化能力的一株乳酸菌：能够耐受1 mmol/L的过氧化氢，完整细胞与无细胞提取物对DPPH自由基与羟自由基均具有较高的清除率，其清除能力与1 mmol/L抗坏血酸相当[14]。本研究发现，适当浓度的乳酸菌可以降低血清中ALT与AST两种指示酶的活力，降低血清和肝脏中TG的浓度，而且还可以改善体内的氧化指标：酒精的摄入使得肝脏中MDA浓度大大升高，GSH质量分数相应减少，而乳酸菌则能够降低MDA浓度，同时增加GSH的质量分数。高剂量的乳酸菌 （浓度为109CFU/mL）具有最佳的治疗效果，能够使机体的各项指标恢复到接近正常的水平。另外，乳酸菌在慢性损伤中的护肝作用要比急性损伤更为有效和显著。

综上所述，本研究所采用的植物乳杆菌LP1001可以对小鼠急慢性酒精性肝损伤发挥一定的保护作用，尤其是高剂量组，各项指标均与模型组有显著的差异并基本接近正常水平，推测其机理可能与乳酸菌较高的抗氧化、清除自由基的能力有关。本实验没有设计药物组，因此可以进一步采用不同药物作为阳性对照，比较LP1001与目前市场上常用护肝药的疗效。由于本菌来源于传统食品，所以可用于发酵食品或与其他成分复配来开发新产品，从而提出了采用食源性微生态干预调节肠道菌群、缓解酒精性肝损伤的新策略。

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Investigations on the effects of Lactobacillus plantarum 1001 on alcoholic liver injury in mice

CHI Fei-fei,TIAN Feng-wei,WANG Gang,LIU Xiao-ming,ZHANG Qiu-xiang,ZHANG Hao,CHEN Wei
（School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China）

Lactobacillus plantarum 1001（LP1001）was screened from Chinese pickles and showed high antioxidative activities.Its effects on alcohol-induced liver injury were investigated in mouse models with acute and chronic alcoholic liver injury.For both liver injury models,40 male Kunming mice were randomly separated into 5 groups：control group,model group,and low,middle,high dose groups of LP1001.The coefficient of hepatic weight,serum alanine aminotransferase（ALT）,aspartate transaminase（AST）,triglyceride（TG）and liver homogenate glutathione（GSH）,malonaldehyde（MDA）,triglyceride（TG）were determined by biochemical assays.Meanwhile,histological analysis was also carried out.The results indicated that LP1001 feeding could lower the levels of ALT,AST,TG and MDA and increase the GSH levels compared to the model group.The effects changed with the dose of LP1001 supplementation and the high dose group was especially superior to other groups.Moreover,the protective effects were even more significant on chronic model than acute model,which was also confirmed by liver pathology changes.Therefore,LP1001 can provide additional protective and therapeutic strategies for both acute and chronic alcoholic liver injuries.

lactic acid bacteria;alcoholic liver injury;mice;oxidative stress

Q939.11+7

A

1001-2230（2012）09-0004-04

2012-03-22

科技部863计划（2011AA100901）。

迟菲菲（1988-），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物。

陈卫