余果宇, 向 阳, 张红芸, 江 萍, 李文辉, 张 云, 张 勇,*

(1. 中国科学院昆明动物研究所 动物模型与人类疾病机理重点实验室, 云南 昆明 650223; 2. 昆明医学院 生物化学教研室, 云南昆明 650500; 3. 中国科学院研究生院, 北京 100049; 4. 昆明医学院 第一附属医院妇产科, 云南 昆明 650032)

三叶因子Bm-TFF2突变体在原核体系中的表达及促细胞迁移活性

余果宇1,2,#, 向 阳1,3,#, 张红芸4, 江 萍1, 李文辉1, 张 云1, 张 勇1,*

(1. 中国科学院昆明动物研究所 动物模型与人类疾病机理重点实验室, 云南 昆明 650223; 2. 昆明医学院 生物化学教研室, 云南昆明 650500; 3. 中国科学院研究生院, 北京 100049; 4. 昆明医学院 第一附属医院妇产科, 云南 昆明 650032)

大蹼铃蟾三叶因子Bm-TFF2具有较人TFF2更强的促细胞迁移和抗凋亡活性。该研究利用RT-PCR方法扩增得到野生型Bm-TFF2的基因, 然后分别构建N端、C端和分子中两个精氨酸突变的突变体, 最后连接表达载体产生pET32a(+)／Bm-TFF2突变型重组质粒, 转入大肠杆菌中, 经37 °C培养, IPTG诱导, 其融合蛋白主要存在于包涵体中, 用组氨酸标签的亲合柱纯化溶解后的包涵体上清, 进一步用 RP-HPLC纯化得到硫氧还蛋白(TRX)/Bm-TFF2突变型融合蛋白。通过SDS-PAGE和Western blotting检测分析其纯度和特异性。最终, 从1L培养基中得到20 mg纯度为95%的三种重组突变型融合蛋白。三种突变型重组蛋白都具有剂量依赖性的促细胞迁移活性, 并且其活性无显著差异。该研究为进一步研究Bm-TFF2结构和功能的关系以及揭示其作用的分子机制奠定了基础。

Bm-TFF2; 突变体; 表达; 纯化; 细胞迁移

三叶因子(trefoil factor, TFFs)是一类含一个或几个三叶因子结构域的分泌蛋白, 该结构域是一段 38或39个氨基酸的多肽, 其中的六个半胱氨基以1-5, 2-4, 3-6配对的构型方式生成三对二硫键, 从而形成典型的三叶状结构, 此结构赋予 TFFs家族蛋白耐酸、碱和蛋白酶水解的性质, 同时也是其行使功能所必需的。人TFFs包括含一个三叶因子结构域、 与乳腺癌相关的多肽(TFF1或 PS2)和小肠三叶因子(TFF3或ITF)以及含两个结构域的解痉挛多肽(SP或TFF2)。TFFs在黏膜防御、修复和再生等过程中通过促进细胞增殖、细胞迁移和对抗细胞凋亡等过程发挥重要作用(Baus-Loncar et al, 2005; Dignass et al, 1994; Oertel et al, 2001; Taupin et al, 2000)。此外, TFFs在多种肿瘤中表达异常的事实提示, 它们广泛参与肿瘤细胞增殖、浸润和转移过程(Cook et al, 1999; Fox et al, 2007; Lalani et al, 1999; Siu et al, 2004)。同时, TFF2表达的增加还常常相关于肿瘤的发展以及不良预后(Dhar et al, 2003; Emami et al, 2004; Katoh, 2003)。Bm-TFF2是从大蹼铃蟾皮肤分泌物中获得的一种具有血小板激动活性的两栖类三叶因子(Zhang et al, 2005), 进一步的研究又发现天然Bm-TFF2以浓度依赖的方式促进人AGS、HT-29以及小鼠肠上皮细胞IEC-6的迁移, 并且ERK1/2活性的激活是其发挥促细胞迁移活性的关键。同时, Bm-TFF2还具有对抗C2-丙烯酰胺引发的细胞凋亡作用, 从而促进细胞的增殖。这些结果提示, Bm-TFF2通过MAPK途径促进细胞迁移并抑制细胞凋亡是其发挥伤口修复功能的基础(Chatterjee et al, 2010)。在进一步对重组Bm-TFF2进行结构与功能研究时, 我们发现全长和单结构域的 Bm-TFF2都具有促细胞迁移和伤口修复活性, 但抗细胞凋亡活性却是全长依赖的, 即 Bm-TFF2的两个单结构域剪切体都无抗细胞凋亡活性(Canas et al, 2009), 提示Bm-TFF2的不同活性需要不同的结构基础。所以, 我们在表达了 Bm-TFF2全长和单结构域的基础上, 利用基因工程的原理和技术, 分别构建和表达了 Bm-TFF2的三个突变体, 并进而检测和分析了它们的促细胞迁移活性, 这为更加深入地揭示 Bm-TFF2的结构与功能关系以及分析可能的分子作用机制奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌 DH5α、BL21(DE3)、表达载体pET-32a(+)购于德国 Novagen公司; 逆转录酶(RNAase H)、限制性内切酶KpnI和EcoR I、PCR聚合酶、T4 DNA连接酶和克隆载体 pMD-19T simple、PrimeScript Reverse Transcriptase购于大连宝生物公司; 动物组织总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购于北京天根生物科技公司; QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit为STRATAGENE公司产品; 组氨酸选择的镍亲合层析胶购于Sigma; 蛋白定量试剂盒购于Bio-Rad; 辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔和山羊抗鼠血清购自美国Santa Cruz生物科技公司; Bm-TFF2多克隆抗血清为实验室免疫兔所得; 三氟乙酸(TFA)、乙氰(ACN)为德国Merck公司产品; C4色谱柱为大连依利特分析仪器有限公司产品; ECL化学发光试剂盒为德国Thermo scientific公司产品; AGS细胞系来自于美国的 American Type Culture Collection; Millicells为美国Millipore公司产品; 其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

表1 BM-TFF2突变体的引物序列Tab. 1 The primer sequences of BM-TFF2 mutants

1.2.1 pET-32a(+)/突变型Bm-TFF2重组质粒的构建取大蹼铃蟾皮肤组织约20 mg, 按总RNA提取试剂盒说明提取组织总 RNA(TRNA), 并用分光光度计和1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和完整性。取一定量的总RNA, 用Oligo(dT)和PrimeScript Reverse Transcriptase逆转录为cDNA。PCR引物由上海生工生物工程公司合成, 各突变体的引物序列见表1。各突变体的正向引物序列都包括KpnI酶切位点(斜体)和对应的N端5个氨基酸序列(黑体), 反向引物序列包括EcoR I酶切位点(斜体)、 终止子(下划线)和相应C端的5个氨基酸序列(黑体)。N端突变体(记为BNM)缺乏N端起始的4个氨基酸, C端突变体(记为BCM)缺乏C端的5个氨基酸。以Bm-TFF2的cDNA为模板, 按照95 °C预变性4 min, 94 °C变性30 s, 60 °C退火30 s, 72 °C延伸30 s, 进行35个循环, 最后72 °C延伸7 min获得PCR产物, 产物通过TA克隆与pMD-19T simple克隆载体连接形成pMD-19T/Bm-TFF2突变型重组质粒, 将重组质粒转化 DH5α。次日, 挑出经蓝白斑筛选的白色克隆并用克隆载体的通用引物M13-47和RV-M行菌落PCR检测。抽提阳性克隆质粒, 用KpnI/EcoR I双酶切后再与相同酶切后的 pET-32a(+)连接形成pET-32a(+)/Bm-TFF2突变型重组质粒, 转化BL21(DE3)并用表达载体的通用引物 S.Tag和T7-Ter行菌落 PCR检测生长的克隆并将阳性克隆测序。构建精氨酸突变体的(记为BAM)正向引物序列：5'-tgctgttttatttcagcaatcgtcaatacaatttggtgctttaaacttaa a-3'; 反向引物序列：5'-tttaagtttaaagcaccaaattgtatttct ccttgctgaaataaaacagca-3'。按照 QuikChange®Site-Directed Mutagenesis Kit 进行操作并测序确认两个精氨酸已经突变为异亮氨酸和缬氨酸。再以该突变质粒为模板, 用BAM的引物扩增, 同上方法操作即可得精氨酸突变的表达载体。

1.2.2 重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化分别挑取测序正确的N端、C端突变以及第44和45位精氨酸各突变为异亮氨酸和缬氨酸的单克隆于5 mL LB培养基, 37 °C, 140 r/min摇过夜。次日晨, 取过夜菌液1 mL接种到1 L含100 μg/mL氨苄青霉素的 LB培养瓶, 相同条件下, 摇菌液至 OD 600为0.6, 加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5 mmol/L, 37 °C诱导4 h。收集菌液, 8 000 g离心10 min获得细胞沉淀。将沉淀悬浮于100 mL冰冷的含0.3 mol/L NaCl、10 mmol/L咪唑、pH8.0的50 mmol/L磷酸盐溶液中, 冰浴中用超声波细胞粉碎机(JY92-2D, 宁波新芝生物科技有限公司)以350 W工作60个循环(工作6 s, 间歇10 s)。4 °C, 15 000g离心30 min, 弃上清, 收集包涵体部份并用Equilibration Buffer(含8 mol/L尿素, 100 mmol/L磷酸盐溶液, pH:8.0)常温溶解4 h, 16 000 r/min, 离心30 min, 取上清并用组氨酸选择的镍亲合层析柱纯化。10倍体积的Washing Buffer(含8 mol/L尿素, 100 mmol/L磷酸盐溶液, pH:6.3)洗脱结合镍柱的非特异性蛋白, 最后用Elution Buffer(含8 mol/L尿素, 100 mmol/L磷酸盐溶液, pH:5.0)洗脱结合在镍柱上的融合蛋白。收集洗脱液并用含6 mol/L尿素的生理磷酸盐溶液于4 °C进行梯度透析, 直至最后用无尿素的生理磷酸盐溶液透析三次, 收集透析液超滤浓缩, 用胶浓度为12%的SDS-PAGE并行考马斯亮蓝染色分析重组融合蛋白的纯化过程。RP-HPLC对超滤浓缩的蛋白液进一步纯化。操作如下：选用C4色谱柱(Zorbax 300 SB C4column, 4×300 mm), 将样品分别上样于预先用含 0.1%TFA的超纯水平衡好的C 4柱, 待穿透峰流出后, 用含0.1%TFA的ACN进行线性梯度洗脱。

1.2.3 重组融合蛋白的鉴定 收集280 nm对应的最高洗脱峰, 抽干TFA和ACN后, 冻干和溶解样品,蛋白定量试剂盒定量。各取等量的 TRX-BNM、TRX-BCM和TRX-BAM融合蛋白行SDS-PAGE (12%)。同时, 遵从Western blotting的操作过程, 将SDS-PAGE胶上的蛋白转印到PVDF膜, 分别用稀释3 000倍的抗Bm-TFF2(实验室免疫家兔制备所得)以及抗TRX抗体(Invitrogen, USA)4 °C反应过夜,再用5 000倍稀释的山羊抗兔和山羊抗鼠血清常温下反应1 h, 化学发光法检测重组融合蛋白的特异性。

1.2.4 突变型融合蛋白的促细胞迁移活性 用包括有10%胎牛血清(FCS)、100 U/mL青霉素、 100 mg/mL链霉素的DMEM和Ham’s F 12 (1:1)培养基于37 °C, 5% CO2的培养箱中培养人胃癌上皮细胞系AGS。待细胞生长状况良好时, 更换细胞培养液,即用无血清的DMEM和Ham’s F 12(1:1)饥饿细胞24 h, 再采用Boyden Chamber(Chemicon, 美国)系统测定细胞迁移活性(Liu et al, 2008)。具体操作如下：胶原(10 μg/cm2)均匀包埋Millcells底部膜的上室面, 取饥饿的过夜细胞, 在每个上室里加入约1.0×105的 AGS, 下室中加入激动剂, 包括 100 nmol/L或 200 nmol/L重组突变型融合蛋白、 10 nmol/L的生长因子作为阳性对照, 100 nmol/L或200 nmol/L重组的 TRX作为阴性对照, 37 °C、5%CO2培养箱中孵育。18 h后, 用枪头和棉签完全移走上室面没有迁移的细胞, 再用含 2%无水乙醇, 0.1 mol/L硼酸(pH: 9.0)配制的0.025%的结晶紫染色液室温下对细胞染色30 min, 10%的乙酸洗脱结合的结晶紫, 在 586 nm波长下读取各实验组的吸光度值, 并计算比较不同激动剂的迁移率。以上实验重复3次。

2 结 果

2.1 pET-32a(+)/突变型Bm-TFF2表达质粒的构建

提取来源于大蹼铃蟾皮肤组织的总 RNA, RT-PCR后分别用对应的突变引物扩增得到BAM、BNM和BCM约310 bp的目的片段(图1 A), 并与pMD-19T载体连接后转化DH5α。, 将双酶切阳性克隆质粒所得的BAM、BNM和BCM基因片段分别连接表达载体 pET-32a(+)形成重组质粒并转化BL21。选择测序正确的阳性克隆, 并用KpnI和EcoR I同时酶切pET-32a(+)/BAM、BNM和BCM重组质粒, 其检测结果如图1 B所示, 三种突变型重组质粒经双酶切后都在相对分子质量为310 bp的位置出现条带, 表明3个突变体分别连接到表达载体的相应位置。

2.2 重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

图1 以大蹼铃蟾cDNA为模板扩增所得的Bm-TFF2突变体的PCR产物Fig. 1 The identification of the Bm-TFF2 mutant recombinant plasmids by taking the cDNA of Bombina maxima as a template

图2 重组Bm-TFF2突变体的构建与纯化Fig. 2 Expression and purification the recombinant Bm-TFF2 mutant proteins

测序方法分别检测每种Bm-TFF2突变体单克隆的正确性。如图2 A所示, BNM的突变是N端缺失了4个起始氨基酸——GFPI; 而BCM的突变是C端缺失了4个终末氨基酸——KPQE; BAM的突变则发生在分子中第44和45位精氨酸上, 两者分别突变为异亮氨酸和缬氨酸。将测序正确的各突变体克隆分别接种于1 L LB培养基中, 37 °C, IPTG诱导4 h, 如图2 B所示, 2道菌液中相对分子质量为33 000的位置出现一条颜色深而粗的诱导条带, 提示诱导后融和蛋白的表达量显著增加, 并且每种融和蛋白在超声破碎后的菌液上清中含量较少(3道), 而主要存在于菌液沉淀, 即包涵体中(4道)。充分溶解包涵体并将离心后的包涵体上清结合组氨酸选择的镍亲合层析柱, 含8 mol/L尿素, pH:5.0的磷酸盐溶液能洗脱与亲合柱结合的蛋白部分, 其纯度可达70%(5道)。为得到高纯度的重组蛋白, RP-HPLC进一步纯化透析后的洗脱液, 当洗脱梯度为 70%时, 280 nm 对应的最高洗脱峰即为纯化的突变型Bm-TFF2重组融合蛋白, 如图2 C箭头所示。

2.3 重组融合蛋白的鉴定

收集各样品在 280 nm处对应的最高洗脱峰,抽干TFA和ACN, 以及冻干和溶解样品。各蛋白样品经SDS-PAGE分析后都在相对分子质量为33 k的地方出现明显的单一条带, 其纯度高达95%(图3 A)。抗Bm-TFF2抗体(图3 B)以及抗TRX抗体(图3 C)对各重组蛋白进行Western blotting检测都在相对分子质量为33 000的位置出现特异性的反应条带,表明纯化所得的蛋白即为原核体系构建表达的突变型Bm-TFF2重组蛋白。

图3 SDS–PAGE和Western blotting分析重组蛋白Fig. 3 SDS–PAGE and Western blotting analysis of the recombinant proteins

2.4 突变型融合蛋白的促细胞迁移活性

促进黏膜细胞再生是三叶因子蛋白的重要功能之一(Taupin and Podolsky, 2003), 而上皮细胞的迁移又是黏膜再生的重要保障。三种突变型Bm-TFF2重组蛋白处理AGS细胞16 h后, 细胞迁移活性明显增强并且呈剂量依赖性, 即100 nmol/L和 200 nmol/L重组蛋白的促细胞迁移活性呈逐渐增强的趋势, 并且200 nmol/L的细胞迁移活性大约是100 nmol/L的两倍。TRX阴性对照的活性变化无统计学意义, 10 nmol/L的阳性对照-EGF与TRX相比具有显著的促细胞迁移活性(图4)。

图4 重组Bm-TFF2突变体的促细胞迁移活性Fig. 4 The activity of epithelial cell migration of recombinant Bm-TFF2 mutant proteins

3 讨 论

三叶因子蛋白在大蹼铃蟾皮肤中有两种存在形式。一种是由三个结构域组成的βγ-CAT的β亚基, βγ-CAT是非晶状体βγ-crystallin和三叶因子蛋白形成的复合物, 具有促细胞迁移和引发细胞凋亡的活性; 另一种是由两个结构域组成, 具有促细胞迁移和细胞增殖活性的 Bm-TFF2(He et al, 2008; Liu et al, 2008)。近期研究又发现重组Bm-TFF2全长以及它的两个单结构域都有促细胞迁移活性, 并且全长 Bm-TFF2还具有抗细胞凋亡活性, 而它的两个单结构域则无此活性, 提示 Bm-TFF2活性的发挥依赖不同的结构基础(Yu et al, 2010)。该项研究通过比较Bm-TFF2和人TFF2蛋白的氨基酸组成发现, Bm-TFF2在40～50位的氨基酸组成中由两个具有亲水性的精氨酸替代了人TFF2中相应位置的疏水性氨基酸, 推测两个精氨酸是其发挥生物学活性的关键, 而且这一区域又常常是 TFF蛋白中受体/配体结合的重要部位(Polshakov et al, 1997; Zhang et al, 2005)。另外, Bm-TFF2在其N端和C端序列组成中也出现了与人 TFF2较大的差异。为此, 我们分别对其分子中的两个精氨酸以及N端和C端序列进行了突变并检测各种突变体的促细胞迁移活性。因此, 该项研究立足于在体外建立原核表达体系以表达 Bm-TFF2突变体并研究其结构和功能的关系。由于原核表达体系是一种较为经济和方便的手段, 加之表达量大的优点, 所以选用 pET-32a(+)体系在大肠杆菌中表达 Bm-TFF2突变体。pET-32a(+)表达重组蛋白时, 其显著的特点是其融合蛋白部份-TRX能够增强目的蛋白的溶解性, 并且有助于分子中二硫键的正确生成(LaVallie et al, 1993; Stewart et al, 1998)。同时, 由于表达的融合蛋白带有6个组氨酸, 所以很容易用组氨酸标签的亲合柱来进行纯化。我们选用原核体系表达N端和C端, 分别缺失 4个氨基酸的 TRX-BNM 和TRX-BCM 突变体以及分子中两个精氨酸突变的TRX-BAM突变体(图2 A)。在表达重组融合蛋白时,如图2 B所示, IPTG诱导后的菌液出现明显的相对分子质量为 33 000的诱导条带, 这与先前野生型Bm-TFF2的表达相似, 但突变型的Bm-TFF2由于分子组成的改变使得诱导蛋白主要存在于菌液沉淀中, 这与野生型 Bm-TFF2的诱导表达有所差异,后者的诱导蛋白主要存在于菌液上清(Yu et al, 2010)。溶解的包涵体上清经组氨酸选择的亲合柱纯化后可得到纯度达 70%的融合蛋白, 再用RP-HPLC进一步纯化能够使目的蛋白的纯度达95%(图3 A)。抗Bm-TFF2抗体(图3 B)以及抗TRX抗体(图 3 C)证实了三种重组蛋白的特异性, 结果显示在相对分子质量为 33 000 的位置出现反应条带, 表明纯化所得的蛋白即为原核体系构建表达的突变型Bm-TFF2重组蛋白。在获得重组蛋白后, 我们进一步对其活性进行了分析。基于三叶因子的重要功能之一是促进黏膜细胞的再生, 而这一功能的完成与细胞迁移活性相关(Taupin & Podolsky, 2003)。同时通过促进黏膜边缘细胞的迁移来发挥伤口修复和治愈的功能(Dignass et al, 1994; Oertel et al, 2001)。因此, 我们检测了三种突变型Bm-TFF2重组蛋白的促细胞迁移活性。结果提示在作用浓度为100～200 nmol/L时, 三种突变型的Bm-TFF2都具有明显的促 AGS细胞迁移活性, 并且这一活性具有剂量依赖性, 即200 nmol/L重组蛋白的促细胞迁移活性显著性高于100 nmol/L, 大约是其活性的两倍。同时, 在相同浓度作用下, 无外源蛋白插入的空载体-硫氧还蛋白的促细胞迁移活性却不明显。与TRX相比, 10 nmol/L的EGF却具有显著的促细胞迁移活性。更为有趣的是, 三种突变型重组蛋白的促细胞迁移活性之间无明显差异, 并且与重组野生型 Bm-TFF2全长以及两个单结构域的促细胞迁移活性之间亦无显著差异。由以上结果可以推论, Bm-TFF2的N端、C端和分子中两个精氨酸的突变体, 甚至是单结构域的 Bm-TFF2都不影响它的促细胞迁移活性, 而这一活性, 是Bm-TFF2发挥伤口修复功能的最基本要素之一。事实上, 三叶因子家族蛋白在胃肠道粘膜的保护和修复过程中发挥着重要功能。它们能与表皮生长因子(EGF)及转化生长因子 α(TGFα)协同作用, 参与损伤组织的上皮重建, 即促进受损黏膜周围完好的上皮细胞向损伤黏膜表面迁移覆盖, 从而促进损伤黏膜的修复(Wong et al, 1999)。ERK1/2的磷酸化常常为细胞迁移活性所必需并且也是TFFs调节信号的关键(Klemke et al, 1997)。研究报道TFFs肽能够促进支气管上皮细胞BEAS-2B的迁移, 而这一活性, 是依赖蛋白激酶C(PKC)和胞外信号调节激酶-ERK1/2的激活, 即ERK1/2的磷酸化(Chwieralski et al, 2004)。

总之, 我们用原核表达体系 pET32a(+)成功表达出三种 Bm-TFF2的突变型重组蛋白, 并用组氨酸选择的亲合柱和RP-HPLC进行纯化, SDS-PAGE和 Western blotting检测了重组蛋白的纯度和特异性, 进而用重组蛋白检测了它们的促细胞迁移活性,结果提示三种突变型 Bm-TFF2重组蛋白都具有剂量依赖性的促细胞迁移活性, 并且其活性之间无明显的差异。这为揭示 Bm-TFF2的结构和功能关系以及解释其作用的分子机制提供了有力的依据, 也为进一步开辟TFFs的生物制药途径奠定了基础。

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Expression of Bm-TFF2 mutants inEscherichia coliand their cell migration-promoting activity

YU Guo-Yu1,2,#, XIANG Yang1,3,#, ZHANG Hong-Yun4, JIANG Ping1, LEE Wen-Hui1, ZHANG Yun1, ZHANG Yong1,*

(1.Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms, Kunming Institute of Zoology,the Chinese Academy of Sciences,Kunming Yunnan650223,China; 2.Biochemistry Section of Kunming Medical College,Kunming Yunnan650500,China; 3.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Beijing100039,China; 4.Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming Yunnan650032,China)

Bm-TFF2, a trefoil factor from the large-webbed bell toad (Bombina maxima), can stimulate cell migration and inhibit cell apoptosis. To study the structure-function relationship of Bm-TFF2, we constructed wild-type and mutated Bm-TFF2 plasmids and expressed recombinant proteins inE. coli. The wild-type Bm-TFF2 gene encoding mature peptide was obtained by RT-PCR, while the N-terminal, C-terminal and two arginine mutated Bm-TFF2 clones were constructed, and ligated into pET-32a(+) expression vectors. The fusion proteins were induced by IPTG at 37°C. The mutant Bm-TFF2 fusion proteins expressed mainly in the inclusion bodies. The mutant (TRX)/Bm-TFF2 could be purified by using Ni2+-chelating chromatography and reverse-phase HPLC from the inclusion body supernatant. The fusion proteins were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. The yield of mutant Bm-TFF2 fusion proteins of above 95% purity was about 20 mg/L. All three recombinant mutant proteins can promote the migration of AGS cells in a dose-dependent manner with no obvious activity difference.

Bm-TFF2; Mutant; Expression; Purification; Cell migration

余果宇(1972-), 女, 博士，研究方向为胃肠肿瘤的分子生物学; 向阳(1983-), 男, 博士生，研究方向为胃肠肿瘤的细胞生物学

Q786; Q959.53

A

0254-5853-(2011)04-0379-07

10.3724/SP.J.1141.2011.04379

2011-01-05；接受日期：2011-05-18

中国科学院“西部之光”(Y102291081); “973”项目(2010CB529800); 国家基金委面上项目(30870304)

∗通讯作者(Corresponding author)，E-mail: Tel: 0871-5194279, E-mail: zhyong@mail.kiz.ac.cn

#共同第一作者(Authors contributed equally to the work)