邵邻相, 吕学维, 邓 刚, 张均平,徐玲玲, 麻艳芳, 毕洁琼

(浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华 321004)

佛手 (fingered citron),学名 Citrus m edicaL.var.sarcodactylis(Noot.)Swingle,为芸香科柑橘属香椽 (Citrus m edicaL.)的变种,又名佛手柑、佛手香橼、蜜罗柑等.佛手性温味辛、苦、酸,具理气止呕、和胃健脾、止咳化痰等功效[1].现代研究表明佛手有增强机体免疫力[2]、抑制小鼠移植性肝肿瘤生长[3]、保护正常细胞[4]和抑菌[5]等多种药用功能.但有关佛手对体外培养肿瘤细胞及其酪氨酸酶活性影响的研究尚鲜见报道.本实验研究了佛手挥发油对体外培养的 B16黑色素瘤细胞增殖及其酪氨酸酶活性的影响,为进一步扩大佛手在药品、化妆品、食品等方面的应用提供重要依据.

1 材料与方法

1.1 佛手挥发油制备与处理

将金佛手果实洗净后切块,机械匀浆,水蒸气回流装置中提取挥发油.无水硫酸钠干燥,过滤,灭菌后称取 100 mg挥发油,加入 10μL无菌吐温-80,涡旋振荡混匀后用磷酸盐缓冲液 (PBS)稀释至 1 mL,涡旋振荡混匀,4℃避光保存.

1.2 试剂

RPM I1640培养基、胰蛋白酶为美国 Gibco BRL公司产品;新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司;台盼蓝、吖啶橙 (AO)、溴化乙锭(EB)、吐温 -80、左旋多巴 (L-DOPA)、曲拉通 X-100(Triton X-100)均为 Sigma公司产品.

1.3 细胞培养

B16黑色素瘤细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所.细胞接种在含 10%新生牛血清的RPM I1640培养基 (含 100μg·mL-1青霉素,100 μg·mL-1链霉素)中,37℃,5%CO2及饱和湿度条件下培养,细胞贴壁生长,用 1 g/L胰酶溶液与0.2 g/LEDTA溶液 (体积比 1 ∶1)消化传代,取对数生长期的细胞用于实验.

2×105cell/mL B16细胞接种于放有盖玻片的 6孔板中,常规培养 12 h后加入佛手挥发油,使其终质量浓度为 62.50,125.00,250.00和500.00μg·mL-1,并设置 0.005%吐温-80作为助溶剂对照组,待药物作用 6 h后取出细胞爬片,进行各项指标检测.

1.4 台盼蓝排斥法测定细胞存活率

用 0.4%台盼蓝试液染色 1 min,计数 200个细胞,正常细胞拒染,死细胞染为蓝色,根据细胞计数结果计算细胞存活率,并计算半数抑制浓度(IC50).

细胞存活率 =(存活细胞数 /细胞总数)×100%.

1.5 瑞-姬氏混染法观察细胞形态

取出细胞爬片,用新鲜配制的甲醇 ∶冰乙酸(体积比 3 ∶1)固定液 4℃固定 1 h,滴加瑞-姬氏染色液 100μL,染色 3 min,用蒸馏水将染液冲净后在倒置显微镜下观察拍照.

1.6 AO/EB荧光染色法观察细胞核形态

采用文献 [6]的方法进行染色,在荧光显微镜下观察拍照.

1.7 酪氨酸酶活性检测

参照文献 [7]的方法并略有改进:62.50,125.00,250.00和 500.00μg·mL-1佛手挥发油处理细胞 6 h后,收集各组细胞用台盼蓝排斥法计数活细胞数,用 1 mL PBS重悬细胞,调整细胞密度为 5×105cell/mL,取 0.5 mL细胞悬液于2 mL离心管中,每管加 1%Triton X-100溶液200 μL,迅速于 -80℃冷冻 30 min,随后 37℃水浴10 min使细胞完全破裂,然后加入 10 g/LLDOPA溶液 50μL,同时用L-DOPA自动氧化作为校准,37℃反应 2 h,以不加药液细胞作为对照,以 0.005%的吐温-80作为助溶剂对照.将上述离心管中含有活性酪氨酸酶的细胞裂解物加入 96孔细胞培养板中,每孔 100μL,每组设 3个复孔,酶标仪 475 nm波长处测吸光度值.

1.8 统计方法

数据以 x ±s表示,采用 SPSS 13.0统计软件进行 t检验和单因素方差分析.

2 结 果

2.1 佛手挥发油对 B16细胞存活率的影响

台盼蓝排斥法测定结果如表 1所示,0.005%吐温-80组 B16细胞存活率与对照组比较无显著性差异 (P>0.05);62.50,125.00,250.00 μg·mL-1佛手挥发油处理 B16细胞 6 h,B16细胞存活率分别为 (80.67±1.61)%,(49.33±1.76)%和 (29.17±1.26)%,与对照组比较均显著下降 (P<0.01);500.00μg·mL-1佛手挥发油处理 B16细胞 6 h后,B16细胞的存活率为(3.17±0.76)%,细胞几乎全部死亡.随着佛手挥发油质量浓度的增大,B16细胞存活率降低,抑制作用增强,并呈剂量依赖性.IC50值为(148.528±0.005)μg·mL-1.

2.2 佛手挥发油对 B16细胞形态的影响

2.2.1 瑞-姬氏混染倒置显微镜观察

如图 1所示,对照组与 0.005%吐温-80组的B16细胞结构完整,多呈梭形,分裂相较多,细胞透明度较高,生长状态良好;62.50μg·mL-1佛手挥发油处理细胞 6 h后,B16细胞成团生长,细胞间界限不清晰;125.00μg·mL-1和 250.00 μg·mL-1佛手挥发油处理 B16细胞后,多数细胞核固缩,染色质凝集呈块状;500.00μg·mL-1佛手挥发油处理 B16细胞后,细胞膜完整性破坏,大部分细胞溶解成碎片,说明细胞已坏死.

2.2.2 AO/EB荧光染色观察

荧光染色中,AO能透过胞膜完整的细胞,嵌入细胞核DNA,使之发出明亮的绿色荧光;EB仅能透过胞膜受损的细胞,嵌入核 DNA,使之发出橘红色荧光.凋亡的细胞呈现为染色增强,荧光更为明亮,均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构.非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征.图 2显示:对照组和 0.005%吐温-80组经 AO/EB染色后,在荧光显微镜下可见细胞结构清晰、胞膜完整,呈均匀一致的绿色荧光 (见图 2中 A和B);62.50μg·mL-1佛手挥发油处理后,B16细胞核呈黄绿色,核染色质浓缩聚集于核膜内侧,呈早期细胞凋亡特征 (见图 2中 C);125.00 μg·mL-1和 250.00μg·mL-1佛手挥发油处理后,B16细胞体积缩小,部分细胞核破裂,细胞核染色质为 EB所染橘红色并呈固缩状或圆珠状(见图 2中 D和 E);500.00μg·mL-1佛手挥发油处理 B16细胞后,细胞膜完整性破坏,细胞核被 EB染成深红色,出现细胞碎片,说明细胞已坏死 (见图 2中 F).

表 1 佛手挥发油对B16细胞存活率的影响 (x ±s,n=3)

图 1 瑞-姬氏混染观察佛手挥发油对 B16细胞形态的影响

图 2 AO/EB染色观察佛手挥发油对B16细胞核形态的影响

2.3 佛手挥发油对 B16细胞酪氨酸酶活性的影响

从表 2可见,0.005%吐温-80组与 62.50 μg·mL-1佛手挥发油处理组 B16细胞酪氨酸酶活性与对照组比较无显著性差异;125.00,250.00和 500.00μg·mL-1佛手挥发油处理组 B16细胞酪氨酸酶活性与对照组比较均有显著下降 (P<0.05),说明 125.00,250.00和 500.00μg·mL-1佛手挥发油对 B16细胞酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用,且随着药物质量浓度的升高,抑制作用增强.

表 2 佛手挥发油对B16细胞酪氨酸酶活性的影响 (x±s,n=3)

3 讨 论

恶性肿瘤是目前危害人类健康的主要疾病之一.天然中药以其疗效广泛、毒性低、副作用小而受到国内外广泛关注.中国是世界公认的天然药物大国,有用中草药治病的悠久历史.

佛手作为传统名贵中药,具有止咳化痰和理气和中等功效[8-9].佛手品种较多,其中以产自金华的金佛手品质最为优良.浙江金华佛手的特点是:果形奇异小巧,留香持久,挥发油含量高[10].赵磊等[11]对 12种金华佛手挥发油成分的比较研究发现,其主要成分为柠檬烯和γ-松油烯.本实验选用金华佛手为实验材料.

细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,目前为止形态学鉴定是检测细胞凋亡最可靠的方法.本实验采用瑞-姬氏混染倒置显微镜观察细胞形态的变化;用AO/EB染色荧光显微镜下观察细胞凋亡,该方法能对正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞作出准确的判断,被公认为是检测细胞凋亡的一个定性定量指标[12-13].

本实验结果表明,佛手挥发油对 B16黑色素瘤细胞生长具有显著的抑制作用,挥发油浓度越高抑制率越大,呈剂量依赖性 (见表 1).低剂量(62.50μg·mL-1)佛手挥发油处理 B16细胞 6 h

后,细胞存活率在 80%以上;倒置显微镜观察到B16细胞成团生长,细胞状态较差;荧光显微镜下可见细胞核呈黄绿色,核染色质凝集于核膜内侧,表明细胞发生早期凋亡.中剂量 (125.00,250.00 μg·mL-1)佛手挥发油处理 B16细胞 6 h后,倒置显微镜下可见细胞核固缩,染色质凝集;荧光显微镜下可见细胞体积缩小,细胞核被染成橘红色,核染色质固缩,表明细胞已进入晚期凋亡.高剂量(500.00μg·mL-1)佛手挥发油处理 B16细胞6 h后,大部分细胞为台盼蓝染成深蓝色,倒置显微镜下观察到细胞膜破裂,部分细胞裂解成细胞碎片;荧光显微镜下可见细胞核为 EB染成红色,部分细胞呈碎片状,表明细胞已坏死.

另外,细胞酪氨酸酶活性检测结果显示佛手挥发油能够显著抑制细胞酪氨酸酶的活性.酪氨酸酶是黑色素合成最关键的限速酶,它的活性越高,生成的黑色素越多.佛手挥发油作为一种天然产物,对人体无毒,并且具有抑制酪氨酸酶活性的作用,因此在美容领域具有很大的开发潜力.

综上所述,佛手挥发油具有抑制体外培养的B16黑色素瘤细胞增殖的作用,并能够抑制细胞酪氨酸酶的活性,低、中剂量的佛手挥发油能够诱导B16黑色素瘤细胞凋亡,高剂量的佛手挥发油可引起细胞坏死.

[1]浙江植物志编辑委员会.浙江植物志:总论[M].杭州:浙江科学技术出版社,1993.

[2]徐晓虹,金晓玲,章子贵.金华佛手醇提液对小鼠记忆、耐力和免疫机能的影响[J].浙江师范大学学报:自然科学版,2000,23(2):180-182.

[3]黄玲,邝枣园.佛手多糖对小鼠移植性肝肿瘤 HAC22的抑制作用[J].江西中医学院学报,2000,12(1):41-42.

[4]CorasanitiM T,Maiuolo J,Maida S,et al.Cell signaling pathways in the mechanisms of neuroprotection afforded by bergamot essential oil againstNMDA-induced cell death in vitro[J].Br J Phar macol,2007,151(4):518-529.

[5]SanguinettiM,Posteraro B,Romano L,et al.In vitro activity of Citrus bergamia(bergamot)oil against clinical isolates of dermatophytes[J].Journal ofAntimicrobial Chemotherapy,2007,59(2):305-308.

[6]邵邻相,张均平,麻艳芳,等.佛手水煎剂对 RAW 264.7癌细胞增殖的影响[J].浙江师范大学学报:自然科学版,2009,32(4):448-452.

[7]姚莉,尚靖,徐建国.B16细胞中酪氨酸酶活性测定的方法学研究[J].新疆中医药,2007,25(4):16-18.

[8]王浴生.中药药理与应用[M].北京:人民卫生出版社,1981:537.

[9]黄泰康.常用中药成分与药理手册[M].2版.北京:中国医药科学技术出版社,1994:1074.

[10]金晓玲,徐丽珊,郑孝华.佛手挥发油的化学成分[J].分析测试学报,2000(4):237-238.

[11]赵磊,籍保平,周峰,等.十二种金华佛手挥发油成分的比较研究[J].食品科学,2006,27(6):179-184.

[12]WalterL,Ernest E,Frederick A,et al.Interleukin-6 delays neutrophil apoptosis via a mechanis m involving platelet-activating factor[J].Journal of Trauma-Injury Infection&Critical Care,1996,40(4):575-579.

[13]吴兴,陈峥嵘,张光健.双重染色法检测人骨肉瘤细胞凋亡[J].肿瘤,2004,24(1):88-89.