徐丽珊, 黄启亮, 吴振珍

(浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华 321004)

原花青素 (proanthocyanidin)是广泛存在于植物的叶、花、果、皮中的天然多酚化合物,是目前国际上公认的天然抗氧化剂,具有较强的抗氧化活性,并能预防心血管疾病,抗肿瘤、抗辐射[1-5].原花青素以其高效、低毒、高水溶性、高生物利用率等特点越来越受到国内外的广泛关注[6-8],并在食品、化妆品领域得到广泛的应用.

目前市场上的原花青素主要从葡萄籽和松树皮中提取.其中葡萄籽来源有限;我国松属植物资源虽然丰富,但松树皮的采集不利于松树的生长.松针是一种可持续利用的天然再生资源,目前关于松针中的活性成分已有一些研究[9-11],但有关松针中原花青素提取的报道很少.为了更好地利用松针资源,充分开发松针中的原花青素,有必要从浙江省分布较多的马尾松、湿地松、黑松的松针中筛选原花青素含量最高的松针,并对其中原花青素的提取工艺进行研究.

目前,对植物中原花青素的提取方法研究较多的有:水浸提法、有机溶剂提取法等[12-13].产业化原花青素提取纯化方法的发展趋势应该是得率高、成本低、方法简便、绿色环保.本实验的目的就是要筛选出一条操作简便、成本低、得率高、所用溶剂绿色、环保的从松针中提取原花青素的工艺路线,为大量生产原花青素及松针的开发利用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

湿地松 (Pinus elliottiiEngel m.)松针、马尾松(Pinus m assonianaLamb.)松针和黑松 (Pinus thunbergiiParl.)松针均采自浙江师范大学校园内,中龄,采样部位为树干的中下部、树枝的中部.

原花青素标准品 (纯度≥95%)购自天津尖峰天然产物有限公司.

1.2 松针提取液的制备

称取一定量剪成 0.5～1 cm长度的松针,按一定的料液比加入提取剂,恒温浸提一定时间,过滤,定容至一定体积,测定原花青素的含量.提取液中原花青素的量与所称取的新鲜松针的量的比值为原花青素的得率.

1.3 原花青素含量的测定

采用硫酸-香草醛法[14].

1.4 松针提取液的紫外分析

将上述松针提取液及原花青素标准品在紫外区下扫描比较.

1.5 单因素实验与正交设计实验

选用提取温度、提取时间、料液比和酸碱度作为单因素实验的考察因素.

利用单因素实验结果,采用 L9(34)正交表,以原花青素得率作为实验结果,确定松针中原花青素的最佳提取条件.

1.6 统计学处理

所有实验重复 3次以上,数据以 x ±s表示,采用 SPSS 13.0统计软件进行方差分析.

2 结果与分析

2.1 松针品种的确定

取等量的马尾松、湿地松和黑松松针,分别按照料液比为 1∶8加水,在 60℃浸提 1 h,比较在该提取条件下不同品种松针的原花青素得率,确定提取原花青素的松针品种,结果见表 1.

表 1 相同条件提取 3种松针中原花青素的得率

从表 1可以看出,在相同提取条件下,3种松针原花青素得率的高低顺序为:湿地松 >黑松 >马尾松.在 3种水提液中,湿地松松针的原花青素含量最高,且显著高于其他 2种松针的含量.因此,选用湿地松松针作为以后研究的对象.

2.2 松针处理方式的确定

取等量的湿地松松针 3份,分别用新鲜 (洗净沥干)、自然晾干 (室温阴干)、烘箱烘干 (50℃烘箱)3种不同方法处理,再按照料液比为 1∶8加水,60℃提取 1 h,测定松针原花青素的提取率,确定提取松针原花青素的原料处理方式,结果见图 1.可以得出,新鲜松针的原花青素提取率显著高于自然晾干和烘箱烘干的.故以新鲜松针为工艺优化的原料.

图 1 松针不同处理方式对原花青素提取的影响

2.3 提取溶剂的确定

取等量的新鲜湿地松松针,分别按照料液比为 1∶8加入 10%,30%,50%,70%,90%的乙醇溶液,以加入等量的自来水 (不含醇)为对照,置于 40℃的水浴锅中浸提 1 h,测定松针原花青素的得率,结果见图 2.

2 不同含量乙醇溶液对原花青素提取的影响

由图 2可知:在含醇量为 0～30%时,松针原花青素的提取率随乙醇含量的增大而提高;但当乙醇含量大于 50%以后,原花青素的提取率开始下降.说明在40℃提取时,以 50%乙醇溶液的提取效果最好.

取等量的湿地松松针 2份,分别按照料液比为 1∶8加入 50%乙醇溶液和自来水,均置于80℃水浴中浸提 1 h,测定松针原花青素的得率,结果见表 2.

表 2 不同溶剂对原花青素提取的影响 (80℃)

从表 2可知,在 80℃水浴中,松针用自来水提取原花青素的得率显著高于 50%乙醇溶液的提取率.并且,以水为提取溶剂,操作简单易行,安全环保,经济有效.因此,选用水提法作为工艺优化的提取方法.

2.4 松针提取液的紫外分析

对松针提取液进行紫外扫描,结果见图 3.

图 3 松针提取液的紫外扫描结果

从图 3可以看出,松针提取液与原花青素标准品的紫外吸收较接近,均在 280 nm左右波长处有较大吸收.由此判断,松针提取液中含有原花青素,只是提取液中的原花青素含量没有标准品高,所以吸收值没有标准品的大.

2.5 水提法最佳工艺条件的确定

2.5.1 单因素实验

在其他条件一致的情况下,研究了不同的提取温度、提取时间、pH及料液比对水提取松针中原花青素的影响.

2.5.1.1 提取温度的影响

取等量的湿地松松针,按照料液比为 1∶8加水,分别在 50,60,70,80,90,100℃下提取 1 h,测定原花青素的得率,结果见图 4.

图 4 提取温度对原花青素提取的影响

由图 4可知,随着提取温度的升高,原花青素的得率呈增加的趋势.

2.5.1.2 料液比的影响

取等量的湿地松松针,分别按照料液比为1 ∶8,1 ∶10,1 ∶12,1 ∶14,1 ∶16加水,在80℃提取 1 h,测定原花青素的得率,结果见图 5.

图 5 料液比对原花青素提取的影响

由图 5可知,随液料比的增加,原花青素的得率随之提高,当料液比为 1∶14之后,趋势稍微平缓.考虑到后续加工中浓缩的成本,液料比选择不宜过高.

2.5.1.3 pH的影响

取等量的湿地松松针,按照料液比为 1∶8分别加入 pH为 4,6,8,10的水,80℃提取 1 h,测定原花青素的得率,结果见图 6.

图 6 pH对原花青素提取的影响

由图 6可知,随 pH值的增大,原花青素的得率急剧下降,以 pH为 4时的提取效果为最好.

2.5.1.4 提取时间的影响

取等量的湿地松松针,按照料液比为 1∶8加水,在80℃分别提取30,60,90,120,150,180 min,测定原花青素的得率,结果见图 7.

图 7 提取时间对原花青素提取的影响

从图 7可以看出:随着提取时间的增加,原花青素的得率呈增加的趋势.提取时间在 30～120 min时,原花青素的得率几乎呈直线上升;在120～180 min时,原花青素的得率变化不大.

2.5.2 正交实验

在上述单因素实验的基础上,以原花青素提取率为指标,采用正交表 L9(34)进行优化正交实验,因素水平选取如表 3所示,正交实验结果及分析见表 4.

表 3 正交实验因素和水平

表 4 松针原花青素提取正交实验结果

由表 4可知,从松针中提取原花青素的最好设计方案为 A3B3C3D1,即最佳工艺条件为 pH 4,提取温度 100℃,提取时间 150 min,料液比1∶14.

2.5.3 最佳提取工艺验证实验

为验证所选工艺为最佳优化工艺,在最优条件下进行了 3次平行实验,所得湿地松松针原花青素的提取率见表 5.

表 5 最佳工艺条件下松针原花青素的得率

由表 5可以知道,A3B3C3D1条件下松针原花青素的得率确实高于表 4中每一项实验结果,确定A3B3C3D1为最佳工艺优化组合.

3 结论与讨论

1)马尾松、湿地松和黑松 3种浙江省常见的松针中,以湿地松松针为原料提取原花青素得率最高;

2)比较了新鲜、晾干、烘干 3种处理方式,结果表明用新鲜松针提取原花青素得率最高;

3)从操作简便、有效、成本低、所用溶剂绿

色、环保等因素考虑,水提法提取湿地松松针中的原花青素优于乙醇提取法;

4)通过单因素实验和正交优化实验确定了湿地松松针中原花青素的最佳提取工艺条件:提取温度 100℃,提取时间 150 min,pH=4,料液比1∶14(g/mL).在此工艺条件下,湿地松松针原花青素得率为 (33.415±0.286)mg/g.

原花青素为极性物质,常用的溶剂为水、甲醇、乙醇、丙酮等.在选择提取溶剂时必须考虑溶解度、安全性、经济性等因素,故不考虑甲醇、丙酮等试剂,而以乙醇、水为溶剂设计实验.

本实验筛选出了一条操作简便、成本低、得率高、绿色环保的从湿地松松针中提取原花青素的最佳工艺路线.我国从 20世纪 70年代中后期到20世纪 90年代中后期,在许多地方种植了大面积的湿地松,形成了多个人工湿地松林区[15],这种既广泛又相对较集中的分布极有利于松针原花青素的加工利用.

本实验主要研究了松针原花青素的最佳提取工艺,还没有对提取所得的松针原花青素进一步纯化,有待今后进一步研究.

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