王友升， 郭晓敏， 姚子鹏， 李丽萍

(北京工商大学食品学院/食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

1株桃果实采后病原真菌的鉴定以及碳源代谢指纹图谱分析

王友升， 郭晓敏， 姚子鹏， 李丽萍

(北京工商大学食品学院/食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

从采后贮藏过程中发病的八月脆桃果实(Amygdalus persica cv.Bayuecui)中分离到1株真菌菌株074#.通过对病原菌形态学观察以及核糖体ITS rDNA序列分析，证明菌株074#为灰葡萄孢霉菌(Botrytis elliptica).致病性试验结果表明，桃果实为灰葡萄孢霉菌的寄主.通过Biolog FF MicroPlate分析该病原菌对95种碳源的利用能力，结果表明，Botrytis elliptica代谢指纹图谱为最适碳源包括 D-果糖、蔗糖、L-苹果酸、琥珀酸、D-葡萄糖酸、L-天门冬氨酸、L-丝氨酸、腺苷、5'-磷酸腺苷等26种，可利用碳源14种，不可利用碳源55种.

桃果实;病原真菌;ITS rDNA序列分析;碳源代谢指纹图谱

桃果实(Prunus persica)为呼吸跃变型果实，采后后熟迅速，极易遭受病原微生物的入侵而发生腐烂［1］.人们对化学农药残留潜在威胁的担忧，促使高效、低毒、低抗性的新型防腐剂的筛选成为国内外研究热点［2］，而防腐剂快速筛选的前提是准确分离到桃果实的致病菌.虽然已报道引起桃果实病害的病原菌有10余种，且主要是真菌［3］，但对于桃果实采后贮藏期间致病菌的研究较少.ITS rDNA内含有可变区间，可用来解决真菌的分类和进化问题［4－6］.Biolog微生物自动分析系统可检测特定菌株对该系统提供95种碳源的利用情况，获得该菌种的碳源代谢指纹图谱［7］.然而，同时结合分子生物学鉴定与Biolog碳源代谢指纹图谱分析病原真菌特征的报道也不多.

本研究分离到1株桃果实采后病原真菌，对该真菌采用ITS r DNA序列分析结合形态学进行分类鉴定，并利用Biolog鉴定系统分析其碳源代谢指纹图谱，以期为桃果实的采后贮藏保鲜过程中病原微生物的控制提供一些参考.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌株分离于采后贮藏过程中自然发病的“八月脆”桃果实.

1.1.2 培养基

1)PDA培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，加水补足1 L，121℃灭菌15 min.液体培养基不加琼脂粉.

2)ME培养基:麦芽浸粉20 g，琼脂18 g，加入一定量的水中，溶解后用NaOH溶液调节pH值至5.5±0.2，121℃灭菌15 min.

1.1.3 试剂

DNA分子量标准(MarkIII和 MarkVII)、10倍PCR Buffer、dNTP、TaqDNA聚合酶，购自天根生化试剂公司;氯化苄、EDTA、NaC1、Tris、氯仿、异戊醇，国产分析纯试剂;通用引物ITS-1和ITS-5由Invitrogen公司合成.

1.1.4 仪器

PCR仪，美国Bio-RAD公司;电泳仪和电泳槽，北京六一仪器厂;HZQ-F全温振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;高速冷冻离心机，德国SORVALL公司;生物安全柜，美国Thermo公司;Biolog鉴定系统，美国 Biolog公司;显微镜，德国Zeiss公司.

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的分离、纯化与回接

分离:用镊子夹取发病桃果实病健交界处到培养基上，于30℃下培养3～5 d.

纯化:观察分离生长出菌落的外观形态，挑选外观生长形态不同的丝状真菌，然后将它们分别转接到PDA和ME培养基上，每个培养平板上转接对称位置的3点位置，于30℃下培养数天，分别选取生长7 d和14 d照相观察菌落生长情况.待生长情况良好后于显微镜下观察菌丝及分生孢子梗等个体形态特征.

回接:用无菌接种针在桃果实表面刺3个孔，取纯化后的丝状真菌块接种至伤口处，在30℃下培养数天，观察果实接种处是否出现病症.

1.2.2 基因组DNA的提取及ITS区PCR扩增与序列测定

用改良后SDS-氯化苄法提取基因组DNA作为PCR反应的模板［8］.ITS区扩增通用引物为 ITS-1(5'-GTAGTCATGCTTGTCTC-3')和 ITS-5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3').PCR反应体系中含 10倍扩增缓冲液 5 μL;dNTP(每种 2.5 mmol/L)4 μL;引物(10 μmol/L)各 2 μL;Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)1 μL;无菌超纯水补足总体积至50 μL.ITS区扩增反应程序为:94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min.72℃延伸l min，30个循环，72℃延伸10 min.反应结束后取5 μL PCR产物加1 μL 6倍溴酚蓝上样缓冲液，在1.5%琼脂糖凝胶上120 V电泳40 min进行检测，EB染色后于紫外灯下观察电泳条带.

1.2.3 序列比对和系统发育树的构建

PCR产物经脱盐纯化后，由天根生化科技(北京)有限公司进行测序.测序结果在GenBank数据库中进行同源序列搜索(BLAST)，比较供试菌株与已知霉菌相应序列的同源性.为进一步显示实验菌株与已知菌株的亲缘关系及其分类地位，根据同源序列搜索结果，提取相关模式菌株的ITS区基因序列，与实验菌株序列一起用Clustal X软件进行匹配排列(align)，用MEGA3.1软件选用参数P-距离(pdistance)和成对删除(pairwise deletion)法，将序列资料转换成距离后以neighbor-joining分析法构建系统发育树，并通过Bootstraps进行1 000次渐启式复制以检验进化树枝的置信度.

1.2.4 碳源代谢指纹图谱的获得

将桃病原菌菌株在PDA培养基平板上30℃培养120 h，用FF—IF浊度标准液配制成均一的菌悬液，调节T=75±2%.在FF微孔板中每孔加100 μL 菌悬液，于30 ℃ 培养，24，48，72，96 h 后分别用Biolog微生物鉴定系统读取结果，获得病原菌对95种碳源的代谢指纹图谱.

2 结果与分析

2.1 菌株的分离、纯化与回接结果

桃果实病健交界处的组织在PDA培养基中30℃培养5 d后，得到1株致密绒毛状、无褶皱、灰褐色的丝状真菌(图1(a))，命名为074#.将074#在PDA平板上纯化后回接到桃果实上，在接种部位出现同样的病症(图1(b))，并能从该病害部位再次分离得到074#.因此，确定丝状真菌074#为桃果实的病原真菌.

图1 丝状真菌074#的分离(a)与回接(b)Fig.1 Separation(a)and re-inoculation(b)of fungal 074#of peach fruit

2.2 形态观察与分析

菌落形态观察结果表明，074#菌株在PDA和ME培养基上30℃培养均生长旺盛，菌落均匀圆形，边缘光滑细致，菌丝渗透在培养基表面浅层，色素产生较少，比较而言，在ME培养基上培养7 d后菌落直径较大(图2(a)、(d)).继续培养至14 d时，菌落向培养基周围的均匀伸展，其中在ME培养基上生长情况较好，后期菌落整体呈现浅黄色，菌丝较短(图2(b)、(e)).

个体形态观察结果表明，074#菌株的菌丝着色较浅，分枝多且内部隔膜观察明显，具有3个或多个隔膜，菌丝顶端有分支，有少量的菌丝渗出液，菌丝小枝对生.分子孢子呈现椭球形，孢子壁光滑，孢子梗浅褐色.菌丝初为白色，后变为黑褐色.分生孢子梗直立，有3～5个分枝，有1～3个隔膜，其顶端簇生葡萄状分生孢子.分生孢子无色至淡褐色，卵圆形或球形，单胞，大小16～32×15～24 μm，顶端具尖突.菌丝生长后期形成菌核.菌核黑色，球形或不规则形，大小0.5～1.4 mm(图2(c)、(f)).

图2 074#菌株在PDA和ME培养基上30℃培养7 d和14 d的菌落特征以及菌丝显微形态Fig.2 Colony characteristics and microscopic shape of No.074 strain cultured 7 d and 14 d at 30 ℃ on PDA and ME medium

2.3 基因组DNA的提取和PCR扩增

采用SDS-氯化苄法提取的074#菌株总DNA经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测后，可以看出所提取的DNA(图3(a))条带清晰，表明提取质量较好.以ITS1和ITS5为引物，经PCR扩增得到的产物的电泳条带特异性强，大小约600 bp(图3(b))，与实验设计吻合.

图3 菌株074#总DNA提取和ITS区r DNA电泳检测图谱Fig.3 Electrophoretogram of total DNA and PCR product of ITS rDNA of No.074 strain

2.4 ITS区r DNA同源性比对与系统发育分析

将分离得到的菌株074#的ITS区r DNA基因部分序列与GenBank内登录的相应序列进行比对，构建鉴定菌株与已知菌株的ITS区r DNA序列进行同源性比对，并且构建系统发育进化树(图4).同源性比对结果表明，074#菌株与Botryotinia fuckeliana，Botrytis elliptica，Botrytis sp. 和 Sclerotinia sclerotiorum的同源性均在98.0%以上.同时，结合所构建的系统进化树结果，可以看出074#菌株与Botrytis elliptica EU519207在同一分枝上，且通过Bootstraps的验证表明它们具有较高的置信度，支持率可达99%.因此，结合形态特征(图2)以及与《真菌鉴定手册》中的灰葡萄孢(Botrytis elliptica)描述进行比较发现结果基本一致，因此可将本研究分离到的074#菌株确定为灰葡萄孢(Botrytis elliptica)［9－10］.

图4 以ITS rDNA基因序列为分子标记的真菌系统进化树分析结果Fig.4 Analysis of fungal phylogenetic tree based on ITS rDNA sequence

2.5 碳源代谢指纹图谱分析

074#病原菌对95种碳源的代谢指纹图谱，见表1.

表1 病原菌074#以及3种同属菌株对95种碳源的代谢指纹图谱Tab.1 Carbon source metabolism analysis of fungal 074#and other three Botryis sp.strains

丙三醇 ++ + + －肝糖 － + ++ +m-肌醇 － － － －2-酮-D-葡糖酸 ++ + + +α-D-乳糖 － + + －乳果糖 － + + +麦芽糖醇 + + + －麦芽糖 － ++ ++ +麦芽三糖 － ++ + +D-甘露醇 － + + －D-甘露糖 － ++ ++ ++D-松三糖 ++ + ++ －D-蜜二糖 ++ + ++ +α-甲基-D-半乳糖苷 － － － －β-甲基-D-半乳糖苷 + + + +α-甲基-D-葡萄糖苷 ++ － － －β-甲基-D-葡萄糖苷 ++ ++ ++ ++异麦芽酮糖 － + + +D-阿洛酮糖 － + ++ +D-蜜三糖 － ++ ++ ++L-鼠李糖 － + + －D-核糖 － + + －水杨苷 + + + －景天庚醛聚糖 － － + －D-山梨醇 ++ + + －L-山梨糖 － + + +水苏糖 － ++ ++ ++蔗糖 ++ ++ ++ ++D-塔格糖 － + + －D-海藻糖 － ++ + +松二糖 ++ ++ ++ ++木糖醇 － + + －D-木糖 － + + ++γ-氨基丁酸 － + － －溴代丁二酸 － + + －反丁烯二酸 ++ + + －β-羟丁酸 － + + －γ-羟丁酸 － － － －p-羟基苯乙酸 － + + －

注:++表示为最适碳源，+表示可利用碳源，－表示不可利用碳源.

表1显示了在30℃培养48 h后，074#病原菌可以利用的最佳碳源有熊果苷、β-环式糊精、糊精、D-果糖、D-葡萄糖酸、α-D-葡萄糖-1-磷酸、丙三醇、2-酮-D-葡糖酸、D-松三糖、D-蜜二糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-山梨醇、蔗糖、松二糖、反丁烯二酸、L-苹果酸、琥珀酸、琥珀酸单甲酯、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-鸟氨酸、L-丝氨酸、腺苷、5'-磷酸腺苷等26种，而可利用碳源种类仅为N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-阿拉伯糖醇、L-海藻糖、葡糖醛酰胺等14种.相比而言，吐温 80、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、戊五醇、苦杏仁苷、D-阿拉伯糖等55种碳源均不能被074#病原菌利用.而Biolog数据库中Botryis属的3种菌株葱腐葡萄孢(Botryis aclada)、番茄灰霉病菌Pers.BGA(Botryis cinerea Pers.BGA)、番茄灰霉病菌Pers.BGB(Botryis cinerea Pers.BGB)最适碳源分别为13种、19种、14种，均小于074#病原菌的最佳碳源范围.

3 讨论

已报道桃果实采后常见的致病菌主要有果生链核盘菌(Monilinia fructicola)、核果链核盘菌(Monilinia laxa)、嗜果枝孢菌(Cladosporium carpophilum)、黄单胞菌(Xanthom onascampestris)、桃炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、葡枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)、扩展青霉(Penicillium expansum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、梨形毛霉(Mucor piriformis)，以及链格孢属 (Alternaria sp.)、小穴壳属(Dothiorella sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)和见拟茎点属(Phomopsis sp.)的某些真菌［11－14］.本研究从采后贮藏过程的发病桃果实上分离得到一株病原菌，并采用ITS区r DNA序列系统发育法、形态特征比对法相结合将其鉴定为灰葡萄孢(Botrytis elliptica).研究表明，灰葡萄孢菌为百合主要致病菌［15］，另外也可侵染豌豆、郁金香、剑兰等植物［16］.然而，在采后贮藏期间的桃果实上目前未见有相关报道.

Biolog系统可测定微生物对不同单一碳源利用能力，代谢特征指纹是微生物菌种鉴定的依据，也可用于鉴别和区分不同来源的微生物群落［17］.本研究发现，3株同属真菌与Botrytis elliptica病原菌共有的最适碳源仅有糊精、D-果糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、蔗糖、松二糖等5种，暗示糊精、D-果糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、蔗糖、松二糖可能是该属真菌的最佳碳源.但Botrytis elliptica碳源代谢指纹图谱与同属的3个菌株之间均存在显著差异，而相同种不同菌株之间的碳源利用情况也不尽一致，这表明Biolog微生物检测系统可用于种间及种内的差异性分析.

真菌致病过程可分为侵染机构的形成，侵入寄主，定繁和扩展三个阶段，而第三阶段的顺利进行与寄主所提供的营养条件密不可分［18］.桃果实中糖主要有蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨糖醇，酸包括苹果酸、柠檬酸和奎宁酸［19－20］，而本研究的结果表明，蔗糖、果糖、L-苹果酸均为灰葡萄孢最适碳源.另外，从Biolog系统的数据库中也可以看出，番茄灰霉病菌(Botryis cinerea)、桃炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、葡枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)、扩展青霉(Penicillium expansum)的最佳碳源均包括蔗糖和果糖，推测桃果实的糖酸成分很适宜灰葡萄孢的菌丝生长.然而，真菌致病性强弱还受所产生的角质酶、真菌毒素以及对植物产生防卫性物质的解毒能力的影响［21］，因此灰葡萄孢对桃果实的致病机理还需进一步研究.

4 结论

1)从采后贮藏自然发病的桃果实上分离得到1株病原菌，经分子生物学结合形态学鉴定为灰葡萄孢(Botrytis elliptica);

2)通过Biolog分析系统，获得 Botrytis elliptica对95种碳源的代谢图谱，其中蔗糖、果糖、L-苹果酸、熊果苷、β-环式糊精、糊精、D-果糖、D-葡萄糖酸等26种为其最适碳源.

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(责任编辑:叶红波)

Identification and Carbon Metabolic Fingerprinting Analysis of a Pathogen Isolated from Postharvest Peach Fruit

WANG You-sheng， GUO Xiao-min， YAO Zi-peng， LI Li-ping
(School of Food/Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

A fungal pathogen，strain 074#，was isolated from infected peach fruit during postharvest storage periods.Morphological characterization and ITS rDNA analysis confirmed that the strain 074#was Botrytis elliptica.The pathogenicity tests confirmed that Amygdalus persica is a natural host of Botrytis elliptica.The Biolog Microbial Identification System with FF MicroPlate was applied for carbon source utilization test of Botrytis elliptica based on their abilities to utilize 95 discrete substrates.And the result showed that the carbon metabolic fingerprinting of isolated strain was composed of 26 optimal carbon sources，including D-fructose，sucrose，L-malic acid，succinic acid，D-gluconic acid，L-aspartic acid，L-serine，adenosine，denosine-5'-monophosphate，as well as 14 available carbon sources and 55 unavailable carbon sources.

peach fruit;fungal pathogen;ITS rDNA sequence analysis;carbon metabolic fingerprinting

TS205;TS201.3

A

1671-1513(2011)01-0047-07

2010-12-13

北京市科技新星项目(2007B011).

王友升，男，副教授，博士，主要从事食品生物技术方面的研究.