崔明勋，姜成哲，李太元

（延边大学农学院，吉林 延吉 133000）

纳豆中SOD的分离纯化及性质的研究

崔明勋，姜成哲，李太元

（延边大学农学院，吉林 延吉 133000）

通过采用不同的溶液、pH和温度处理探讨了对SOD提取物活性的影响，采用硫酸铵沉淀法粗提，葡聚糖凝胶过柱，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法判定纯度。结果表明，提取时纳豆捣碎与否结果没有差异，采用缓冲液效果较好。采用50℃以上的温度处理影响酶活性，硫酸铵饱和度在65%～90%时得到较纯的酶粗提物，pH5.9的条件下有利于分离纯化，得到了分子量为3.86×104u的Fe-SOD型SOD。

纳豆；超氧化物歧化酶（SOD）；pH；温度

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）广泛存在于各种生物体内，微生物、动物和植物都含有SOD[1]，按金属辅基的不同分为3种类型，存在于真核生物的Cu-Zn-SOD，存在于真核生物线粒体及少数原核生物中的Mn-SOD，存在于原核生物的Fe-SOD[2]。SOD是生物体分解超氧阴离子的主要金属酶，在防止生物体免受氧自由基损伤，提高人体免疫力，延缓机体衰老等方面起重要作用[3]，对类风湿、关节炎等疾病的治疗有显著疗效，在日用化工产品及食品领域的应用也越来越广泛[4]。因此，需要安全可靠易生产的来源以满足需求。

纳豆是日本传统的大豆发酵食品之一，是将大豆用枯草芽孢杆菌或纳豆菌发酵而成的[5]，具有较高的营养价值。在纳豆激酶被发现以来，其作为功能性食品更为人们所关注，研究资料表明，其具有溶血栓、控制骨质疏松症的发展[6]、抗氧化、降血压等作用。并且也是较安全、廉价的食品。

本实验对纳豆中SOD的分离纯化条件进行了摸索，寻找最佳方案，对分离得到的SOD的一些性质进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

纳豆：由吉林省延边草仙药业公司提供；邻苯三酚：上海生化试剂所；考马斯亮蓝G-250：上海绿鸟科技发展有限公司；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、NaCl：分析纯,天津市化学试剂六厂；牛血清白蛋白：Simga公司；SDS-PAGE低分子量标准蛋白质：上海升正生物技术有限公司；葡聚糖凝胶：上海化学试剂公司分装厂。恒温水浴锅：北京市医疗设备厂；部分收集器、核酸蛋白检测仪：上海青浦沪西仪器厂；722S型分光光度计：天津市普瑞斯仪器有限公司；超纯水系统：Millipore公司；低温冷冻离心机：Hitachi公司；笔型酸度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 纳豆SOD提取方法的选择

1.2.1.1 不同提取液及处理对纳豆SOD活力的影响

取8份纳豆，每份15g，分成两组，其中一组把纳豆捣碎，一组直接使用，分别加入蒸馏水、0.1 mol/L磷酸钾缓冲液、0.1 mol/L磷酸钠缓冲液、0.9%氯化钠溶液各30 mL，在摇床上振荡1 h，4000 r/min 离心 15 min，取上清液，进行SOD活力和蛋白含量测定。

1.2.1.2 不同温度对纳豆SOD活力的影响

称38 g纳豆，加入76 mL蒸馏水，振荡1 h，离心，取上清液，分成10份，1份4℃保存，剩余的分成3组，分别放入40、55和70 ℃水浴中，在10、25、40 min时各取出1份，迅速放入冰浴中冷却，测定SOD活力和蛋白含量。

1.2.1.3 不同pH对纳豆SOD活力的影响

取纳豆45 g纳豆，加入90 mL蒸馏水，振荡1 h，离心，取上清液，取等量6份，用0.5 mol/L HCl溶液或0.5 mol/L NaOH溶液调整纳豆洗液的pH分别为4.5、5.5、7、8.5、10、11.5。置4 ℃冷藏，过夜后，4000 r/min 离心20 min，取上清液调整pH为7，记录上清液的体积并检测SOD活力和蛋白含量。

1.2.2 纳豆SOD的纯化

1.2.2.1 纳豆SOD的粗提

称取纳豆，加0.05 mol/L的磷酸缓冲液洗涤，收集洗涤液，4800 r/min离心30 min，取上清液边搅拌边加入硫酸铵粉末，使饱和度达到65%～70%之间，4℃冷藏过夜，取出离心，收集上清液，再加入硫酸铵粉末，使饱和度达到90%，过夜，离心，取沉淀加水溶解，放入透析袋中透析24 h。

1.2.2.2 葡聚糖凝胶过柱纯化

取出透析过的溶液，加入0.5 mol/L pH5.9的磷酸缓冲液，检测溶液的pH，达到5.9后，冷藏，过夜，4000 r/min离心20 min，取上清液，用透析袋浓缩，浓缩液离心，上清液用葡聚糖凝胶G-50过柱，洗脱液用0.05 mol/L pH5.9磷酸缓冲液，经核酸蛋白检测仪280 nm处检测，结合SOD活力测定，收集有活力的部分，用透析袋浓缩，浓缩液离心，上清液如上条件，再过葡聚糖凝胶G-150，活性部分浓缩后，离心，上清液冷冻保存。

1.2.2.3 电泳

首先采用7.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，判定蛋白质分离的效果，直到出现一条蛋白带，再使用15%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，以SDS-PAGE低分子量标准蛋白质作基准，计算SOD的分子量。

1.2.3 纳豆SOD性质

1.2.3.1 纳豆SOD类型

采用氯仿-乙醇溶液和H2O2对SOD活力抑制的方法进行SOD类型的鉴定[7]。

氯仿-乙醇（按体积比2∶3）溶液按0%、10%和40%的比例与20%的酶液混合，在25℃处理10 min，测定酶的活力，并以等量抑制剂做空白对照进行计算。

配制20 mmol/L和10 mmol/L的过氧化氢溶液，与酶液1∶1混合，使其终浓度达到5 mmol/L和10 mmol/L，分别在25℃处理10 min和20 min，以加蒸馏水的酶液作对照，测定酶活力。

1.2.3.2 纳豆SOD温度稳定性

从冰箱中取出酶液，取等量的酶液，分别在20、40、55、70、85℃的温度下保温20 min，加热过的取出后迅速冷却，测定酶活性。

1.2.4 SOD活力的测定

采用修正的联苯三酚自氧化法[8]。

酶活力单位的定义：在一定条件下，在1 mL反应液中，每分钟抑制联苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为1个酶活性单位（U）。

1.2.5 蛋白含量的测定

采用考马斯亮蓝法。用牛血清白蛋白做标准蛋白。

2 结果与讨论

2.1 纳豆SOD提取方法的选择

2.1.1 不同提取液及处理对纳豆SOD活力的影响

纳豆使用不同溶液洗涤的结果（见表1），4种不同的溶液洗涤得到的酶液，方差分析结果，SOD比活力之间，用磷酸缓冲液洗涤的与用蒸馏水洗涤的之间差异极显著，与用0.9%NaCl洗涤的之间差异显著。用蒸馏水洗涤的活力最低。而捣碎的纳豆和没有捣碎的纳豆之间，没有显著差异，可以认为该酶是纳豆菌分泌出来的，酶蛋白主要存在于纳豆的表面。从比活力来看，用磷酸缓冲液洗涤的比活力较高。

2.1.2 不同温度对纳豆SOD活力的影响

纳豆用蒸馏水洗涤的粗提液，测定SOD活力和蛋白含量的结果，放到4℃下的活力为（115.3±9.74）U/mL，蛋白含量为（0.52±0.03）mg/mL，比活力为（219.9±7.76）U/mg。40℃下分别处理10、25、40 min的结果表明与4℃下处理的没有差异，而比活力随着温度的提高极显著地降低，经方差检验40℃时与55℃和70℃之间存在着极显著差异。处理时间的延长，活力和蛋白含量都有所降低，比活力之间差异不显著（结果见表2）。

2.1.3 不同pH对纳豆SOD活力的影响

对纳豆水洗液分别经过1 mol/L HCl溶液调整为酸性，用1 mol/L NaOH溶液调整为碱性，4℃过夜等待蛋白质沉淀，取上清液，再把所有的溶液pH调为7，测定蛋白质含量和SOD活力的结果，蛋白质含量pH 4.5和11.5的降低较多，而pH10的含量最多，SOD活力也有类似的变化，其变化从比活力值来看，pH 4.5降低最多，然后是pH 11.5、5.5的，见表3。pH对酶活性的变化规律与Cu,Zn-SOD的变化相似[9]，而pH 6时SOD比活力略低于最高值，见图1。

表 1 不同溶液和处理对纳豆SOD活力及比活力结果（x±SD）Table 1 The results of different solution and treatment on specific activity of SOD

表 1 不同溶液和处理对纳豆SOD活力及比活力结果（x±SD）Table 1 The results of different solution and treatment on specific activity of SOD

注：**表示与蒸馏水相比差异极显著；#表示与0.9%NaCl相比差异显著。

表 2 不同温度和时间处理对纳豆SOD活力和比活力结果Table 2 The results of different temperature and time treatment on specific activity of SOD

表 2 不同温度和时间处理对纳豆SOD活力和比活力结果Table 2 The results of different temperature and time treatment on specific activity of SOD

表 3 不同pH处理对纳豆SOD活力的结果Table 3 The results of different pH treatment on specific activity of SOD

表 3 不同pH处理对纳豆SOD活力的结果Table 3 The results of different pH treatment on specific activity of SOD

pH 4.55.578.51011.5蛋白浓度/（mg/mL）3.1±0.13.34±0.23.33±0.153.48±0.063.65±0.252.9±0.03活力/（U/mL）229.68±31.89586.46±38.91734.58±20.1797.9±53.53806.82±40.86381.34±40.8比活力/（U/mg）73.84±7.93176.69±22.26220.85±3.61229.16±11.59221.23±4.02131.51±12.52

2.2 纳豆SOD的纯化结果

2.2.1 纳豆SOD的粗提和过柱

称取100 g纳豆，用200 mL蒸馏水分次洗涤，洗脱液经45%硫酸铵沉淀，出现大量的沉淀物，但其蛋白质含量很低，饱和度达到70%时，沉淀中有蛋白质出现，饱和度达到90%后，沉淀有DOS活性，离心后的上清液黏度降低，并变得透明。

过柱前用0.5 mol/L pH5.9的磷酸缓冲液处理，虽然对SOD活性有一定的影响，可以减少杂蛋白，特别是降低溶液的黏度，有利于过柱分离。过葡聚糖凝胶G-50的洗脱液经过280 nm检测时，得到的吸收峰是一个较宽的单峰，峰的前部分具有SOD活力，而后部分的吸收峰SOD活力低或无活力，收集液能够看到白色的混浊现象。过葡聚糖凝胶G-150后，出现前后两个峰，也没有彻底分开，前峰有活性。经过多次过柱，提纯倍数达到22.2倍，得率为23%。

2.2.2 电泳

采用7.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳时，有活性的部分总有一条跑的最快的带，比牛血清白蛋白跑的还快，经多次过柱，得到一条带，所以认定为SOD蛋白带。经15%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量，分子量为3.86×104u，与文献[10]中所述相一致。

2.3 纳豆SOD性质

2.3.1 纳豆SOD类型

提纯的酶液用氯仿-乙醇溶液处理，以没加氯仿-乙醇溶液为对照，10%的活力为对照的89%，抑制效果较低。而40%的相对活力将为44%。出现明显的抑制作用，见图2。

5 mmol/L的H2O2处理10 min时，抑制率为98%，抑制作用很低，10 mmol/L H2O2处理的10 min时已经开始出现抑制作用抑制率为81%，在20 min时，两种浓度下的抑制能力相似，为51%，见图3，说明随着时间的延长，H2O2出现抑制作用。

两种处理对酶的活力都有抑制作用，说明酶的类型应是Fe-SOD。

2.3.2 纳豆SOD温度稳定性

酶液经过不同温度处理，活性以放在20℃的为准，得到相对活力，见图4，活性最高是40℃下保温的，相对活性达到123%，而55℃和70℃的，活性已经降到66%和61%，此结果与提纯前的酶活力比较，放置在20℃下的酶活力比40℃处理的低，与提纯前的不同，可能与提纯过程及条件变化有关，其它的结果都相似。在85℃处理的，活性已下降到了41%，比文献[11]中耐高温微生物产的SOD在55℃和75℃时热稳定性较差，比起Cu，Zn-SOD热稳定性在55 ℃时也低[12]。因此，纳豆烹饪时，应该考虑比其它来源SOD需要较低的温度。

3 结论

从纳豆中提取SOD过程来看，最大的障碍是纳豆洗液的黏度，其黏度主要是由于纳豆中存在的大量γ-聚谷氨酸所造成[13]，在分离提纯的每一步骤都产生干扰。提取条件来看，使用磷酸缓冲液有利于酶液的提取，不能采用提高温度的方法来达到纯化酶的目的，纯化时采用pH5.9的缓冲液，虽然不是酶的最适pH，对酶的活性有一定的影响，但可以有效降低酶液的黏度，有利于分离提纯。此SOD的类型是Fe-SOD型，分子量约为3.86×104u，并认为是纳豆菌分泌性酶。

参看文献：

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[2]杨明琰，张晓琦，沈俭，等.微生物超氧化物歧化酶的研究进展[J].微生物学杂志,2004,24(1)：49-51

[3]宫莉，丛娟，王晓俊,等.酵母SOD高产菌的选育及发酵条件[J].长春工业大学学报：自然科学版，2006，27(3):204-207

[4]陈彦斌，詹现璞，张宏盈，等.SOD的保健作用及在乳制品中的应用[J].中国乳业,2007(5):40-44

[5]段智变，江晓，江汉湖，等.纳豆提取物对实验性高脂血症的作用研究[J].食品与发酵工业，2002,28(12)10-13

[6]陈丽娟，沙长青，新伟，等.国外纳豆激酶的开发现状[J].生物技术，2003，13(3)：44

[7]刘妮娜，姚忠，叶艳华，等.耐盐节杆菌Arthrobacter pascens DMDC12中Mn-SOD的纯化及性质[J].食品与生物技术学报，2008，27(1)：103-108

[8]庞战军，周玫，陈瑗.自由基医学研究方法[M].北京：人民卫生出版社，2000：110

[9]袁勤生，陈浩，姚菊芳，等.牛马血超氧化物歧化酶的制备新工艺[J].生化药物杂志，1991,56(2)：20-22

[10]郭中满，苟仕金，殷礼.超氧化物歧化酶研究进展[J].中国兽医科技，1991，21(4)：45-47

[11]王忠彦，黄英，胡永松.一株耐高温SOD产生菌的筛选及酶学特性[J].微生物学报，1997，37（4）：307-311

[12]袁勤生，陈浩，朱利民.Cu,Zn-SOD理化性质的比较[J].华东化工学院学报,1992,18(3)：291-295

[13]张春岭，郭爱玲.纳豆中γ-PGA的分离纯化和鉴定[J].农产品加工学刊，2007,10(115):：78-83

Study on the Extracting and Purification Superoxide Dismutase（SOD）from the Natto

CUI Ming－xun，JIANG Cheng－zhe，LI Tai－yuan
（Agriculture College，Yanbian University，Yanji 133000，Jilin，China）

Through the use of different solutions，pH and temperature process of combining，tested the SOD activity.Crude SOD was extracted by the method of ammonium－sulfate precipitation，the Sephadex gel，the polyacrylamide electrophoresis to decided the purity.There was no different result purity that with or without mash，buffer solution was better.More than 50℃ deal with effects of the enzyme activity and ammonium－sulfate reveal the humidity at 65%-90%had a pure crude enzyme extraction，pH5.9 conditions conducive to the separation，purification，the molecular weight for 3.86×104u Fe-SOD type were obtained.

Natto；superoxide dismutase（SOD）；pH；temperature

延边大学科技发展项目（2009第015号）

崔明勋（1966—），男（朝鲜），副教授，博士，主要从事药理学和生物化学研究。

2011-06-11