王新霞，宋雪玲

(1.延安大学附属医院；2.延安市药品检验所，陕西 延安 716000)

管碟法对抗生素药品效价的微生物检定

王新霞1，宋雪玲2

(1.延安大学附属医院；2.延安市药品检验所，陕西 延安 716000)

目的减少实验过程中外界因素与人为因素给试验带来的误差，提高管碟法测定抗生素效价的准确性。方法按药典操作步骤逐步分析，规范操作，并提出合理的解决方案。结果得到清晰、圆整的抑菌圈。结论可以提高测定结果的准确性。

抗生素效价；生物检定法—管碟法；抑菌圈

抗生素是医疗上广泛使用的药品[1]。由于抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌效力，利用抗生素对细菌(霉菌)的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量抗生素的效力。根据此原理，设定了抗生素效价的生物检定法—管碟法。

1 基本原理

管碟法是利用抗生素在琼脂培养内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。

管碟法的特点是灵敏度高，能直接显示抗生素的抗菌效价，但操作步骤多，试验过程长。影响试验结果的因素较多，需要从各个环节加以严格控制试验条件。本文就对试验中各项影响因素的控制加以讨论。

2 影响因素

2.1 抑菌圈圈正的控制

在某些情况下，抑菌圈出现破裂，呈椭圆形，卵圆形等不正常形状，其原因[2]可能如下：(1)在滴加抗生素溶液至小管时，抗生素溶液从小管口或毛细滴管口溅出落在琼脂培养基表面上。防止方法：毛细滴管内不得有气泡，毛细滴管口避免太细，毛细滴管离小管口距离不要太高，适当调节，使液滴下滴时不致溅出。(2)小管两端面不够平，使抗生素溶液漏出，破坏了均匀扩散现象。必须使用加工相同的小钢管。如都用二端面平面的，或都使用二端面圆的。(3)玻璃双碟、小钢管、钢管放置器被微量抗生素(或其他杀菌剂)污染，使抑菌圈破裂。对这些双碟需用清洁液浸泡，再清洗干净，方可使用。小钢管使用久后，表面发乌、不亮、不光洁，容易残留抗生素等。这时应用洗涤剂擦洗小钢管内、外壁及二端面，经清洁干净即可使用。(4)在制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或受热时间太长，可使试验菌部分或全部被杀死。培养基温度可按试验菌种不同来调节(见表1)。(5)琼脂培养基上，小管彼此间隔距离太小而抑菌圈较大时，形成互相影响的卵圆形或椭圆形抑菌圈。调正抑菌圈的直径，如增加菌层培养基内的试验菌量，降低抗生素溶液的浓度。(6)双碟培养过程中，温度不均匀。控制方法：孵箱传温应均匀，每组双碟放在同一层盘内。在培养过程中，不宜再开启，以免影响孵箱内各部分的温度均匀性。(7)双碟底不平或制备琼脂培养基平板时，工作台不够水平，也可使抑菌圈不圆。控制方法：挑选底平的双碟及用水平仪，设法使工作台垫平。(8)培养基融化不完全或融化后温度下降，培养基内有小凝块，有时不易觉察。至倒菌层时始发现。控制方法：在菌层培养基融化后，移置水浴箱中。水浴箱温度一般用50℃适合，切勿急速冷却，往往易发生凝块。

表1 试验用菌液的培养温度

2.2 抑菌圈边缘清晰度的控制。

在某些情况下，抑菌圈边缘出现模糊、不光滑、呈锯齿形或双圈等现象，其原因可能如下：(1)试验菌种的纯化当试验菌群中含有两种对抗生素敏感度不同的菌株时，可能出现双圈。因此，定期对试验菌种作单菌落分离，挑选典型的菌落移种后，再作抑菌圈试验，选出较理想的菌种。(2)抗生素对试验菌抑菌作用或杀菌作用的强弱，也能影响抑菌圈边缘清晰度，因此要选择适当的试验菌。(3)调节培养基的pH值一般来说，碱性抗生素在偏碱性的培养基和缓冲液条件下，抗菌效力表现较强。酸性抗生素在偏酸性条件下，抗菌效力较强。两性抗生素在偏酸性条件下，使溶解度增高，抗菌效力表现较强。(4)试验菌的菌量和菌龄在有些试验菌菌量过少时，抑菌圈边缘模湖不清。但试验菌量过多，也会使抑菌圈太少，并且影响试验的灵敏度。因此，只以通过实验来适当调节。陈旧的试验菌培养物，往往使抑菌圈模糊。用经过纯化的菌种，转种后经18～20 h的培养物为好；芽孢悬液也以新鲜制备的为好。(5)调正双碟的培养时间双碟培养在接近16 h左右，要注意密切观察。培养时间过短，常表现为抑菌圈边缘模；培养时间过长，往往使菌丝向抑菌圈内生长，使边缘不整齐。(6)调正抗生素溶液的浓度对某些溶解度很低的抗生素，应先用适当的溶剂使其溶解后，再用缓冲液稀释。

2.3 标准品与供试品同质的要求

效价测定的计算式，是假定两者剂量反应直线是互相平行的。如不相平行，计算结果必定发生较大误差。两者不相平行的原因，除操作上可能引入的误差外，主要是标准品与供试品内在质量有质的不同。此外，标准品与供试品所用的稀释用缓冲液不同时，两者剂量反应直线也不平行。

3 讨论

试验中，往往会出现异常情况，使得试验结果与预期出现很大差异。因此抗生素试验的每一步都需要仔细谨慎，严格按照操作规范，才可以得到准确的检测结果。准确测定抗生素效价，对评价抗生素的治疗效果，指导临床应用都有着重要意义。抗生素效价测定对检验人员的检验技能有着很高的要求，这需要检验人员在试验过程中不断的摸索，尽可能的减少实验误差，规范操作，给抗生素的质量提供可靠的检验数据。测量抑菌圈是本法取得试验结果的重要环节。目前大都使用抑菌圈面积测量仪，是当今理想的抑菌圈测量仪器。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京：化学工业出版社，2005：79.

[2]张治锬抗生素药品检验[M].北京：人民卫生出版社，1991：12-34.

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1672-2639(2011)03-0058-01

2011-04-17；责任编辑徐文梅]